用ImagePro-Plus-分析免疫组化图片.ppt

2.3ImageProplus(IPP)的独特优势。准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI(areaofinteresting)。测量这个区域的光密度参数。使用IPP比前两种方法更好。在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的图象分析方法及图象分析程序的。12选取图片上具有染料色调的区域（AOI，areaofinteresting）。1测量该区域的IOD。2选择并测量有效统计区域的面积3计算选择区域内的光密度平均值IOD/area（densitymean）4计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。5用统计学方法分析各实验组的平均densitymean之间是否有显著性差异。63.用IPP分析免疫组化图片过程1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清晰.不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。6%的灰度滤光片会导致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。显微镜光源不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。01为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。02固定显微镜的工作条件应该使用手动控制曝光的相机对每张照片要使用相同的曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。1要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。2拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。3把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上调节100%透射。控制相机曝光时间背景的影响左图：暗且偏蓝的背景严重降低了黄色的IOD值。而且影响到了阳性区域的色调。较暗的背景值对分析测量的影响显著性差异无显著性差异扣背景后依然没有显著性差异注意误差线，依然没有显著性差异避免使用相机的自动白平衡自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进行各自不同的白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不能校正。由于免疫组化照片上黄色染色多,自动白平衡会将图片色调向蓝色调整,导致色彩的失真.0102不使用自动白平衡校正，但可以使用手动的白平衡校正背景色彩。对所有照片进行统一的背景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面貌，严重影响照片的分析测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。最好使用专业CCD拍摄应当把照片存为无损压缩格式TIFF特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。要注意相机上直接保存为jpeg的图片就没必要转成TIFF了.注意那些马赛克调整显微镜光源亮度，足够白，足够亮。1调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。2确认相机未使用自动白平衡功能。但可以使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。3使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一次拍摄完所有照片。4保存照片为TIFF格式。5总结拍摄注意事项：3.2用Image-proplus分析免疫组化图片与photoshop不同，image-proplus是一个图片分析测量软件。IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应当准确地反映图片本身的真实测量数据。IPP的程序界面是典型的windows风格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。进入IPP后的第一件事就是打