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肌动蛋白Actin染色步骤详解

肌动蛋白Actin在活细胞中是一种动态、易变的结构。Actin的染色可用于确定固定细胞和活细胞中细胞骨架的结构和功能。Cytoskeleton作为细胞骨架

和小G蛋白研究专家，可提供全面的骨架蛋白染色试剂及方案。接下来，小优分别给大家介绍固定细胞和活细胞中Actin的染色步骤。

一、固定细胞中的Actin染色步骤

在固定细胞中，肌动蛋白结构可通过荧光鬼笔环肽（phalloidins）、肌动蛋白抗体来观察：荧光鬼笔环肽只与F-actin的原生四级结构结合，所以具有低

背景。抗体识别单体和多聚体肌动蛋白（丝状或F-actin），因此与仅结合F-actin的荧光鬼笔环肽相比，往往具有高背景。另外确保使用适当的固定剂以保持

Actin的天然结构至关重要，在使用荧光鬼笔环肽进行actin染色时，推荐使用多聚甲醛作为固定剂，因为多聚甲醛能够保留Actin的四聚体结构，有利于高亲

和力结合荧光鬼笔环肽；避免使用冷甲醇，因为甲醇会破坏Actin的天然构象，不利于与荧光鬼笔环肽结合。

1.使用荧光鬼笔环肽进行actin染色的步骤（以Acti-Stain488Phalloidin，Cat.#PHDG1-A为例）：

1)将3.5μl荧光鬼笔环肽储备液（14μM）稀释到500μlPBS中，制备成100nM的Acti-Stain488Phalloidin工作液。室温下避光保存；

2)取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；

3)弃去培养基，用PBS轻轻洗一次细胞（室温）；

4)将盖玻片转移到湿盒中，每张盖玻片上滴加200µl固定液（含3.7%多聚甲醛的PBS，pH=7.0），室温固定10min；

5)用PBS轻轻冲洗细胞30s（室温）；

6)每张盖玻片上滴加200µl通透剂（含0.5%TritonX-100的PBS），于湿盒中室温通透5min；

7)用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30s（室温）；

8)滴加200ul100nM的Acti-Stain488Phalloidin工作液，于湿盒中室温避光孵育30min；

9)用PBS冲洗盖玻片三次，每次30s（室温）；

10)（可选）滴加200ul含100nMDAPI的PBS，室温染色30s；

11)（可选）用PBS冲洗盖玻片30s（室温）；

12)用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂；

13)静置20min晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24h。

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图1：使用Acti-Stain488Phalloidin对Swiss3T3细胞进行actin染色。整个细胞中actin被染成绿色（图源产品说明书）

文中部分相关产品：

Acti-stain™488Phalloidin，PHDG1-A（非常稳定的绿色荧光，用于固定细胞Actin染色）

RhodaminePhalloidin，PHDR1（红色荧光，用于固定细胞Actin染色）

Acti-stain™555Phalloidin，PHDH1-A（非常稳定的红色荧光，用于固定细胞Actin染色）

Acti-stain™670Phalloidin，PHDN1-A（远红色荧光，用于固定细胞Actin染色）

2.使用肌动蛋白抗体进行actin染色的步骤（以Anti-PanActinMouseMonoclonalAntibody(Clone7A8.2.1)，Cat.#AAN02为例）：

1)取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；

2)弃去培养基，用PBS轻轻洗一