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Optimizedprotocol：neutrophilspanel中性粒细胞流式检测优化方案

一、Human骨髓和脐带血中性粒细胞

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1.分步样品制备

(1)Human骨髓中性粒细胞

①在含有ACD-A(酸-柠檬酸-葡萄糖配方A)的肝素生理盐水中收集供体骨髓。

②用2ml的1倍PBS洗涤样品。4℃，400×g离心5分钟，丢弃上清。执行单元格计数。

③使用500万个细胞，使用纯化的抗人CD16/32Ab在4°C下阻断fc受体30分钟。加入含抗体的染色缓冲液，4℃

孵育30min。

④用PBS洗涤样品，4℃，400×g离心5分钟，丢弃上清。

⑤用500μL1×红细胞溶解缓冲液溶解红细胞3分钟，洗涤。

⑥添加DAPI并获取细胞。

(2)Human脐带血中性粒细胞

①每100μL脐带血用1mL1×RBC缓冲液溶解红细胞。室温下孵育6分钟或直到样品变成半透明。

②用1倍PBS中和。4℃，400×g离心5min。

③使用500万个细胞，使用纯化的抗人CD16/32Ab在4°C下阻断fc受体30分钟。加入含有抗体的染色缓冲液，4℃

孵育30min。

④用PBS洗涤样品，4℃，400×g离心5分钟，丢弃上清液。添加DAPI并获取细胞。

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2.Human中性粒细胞检测指标

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3.Human中性粒细胞流式分型检测推荐Panel

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4.数据分析

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人脐带血中性粒细胞的门控策略。

首先排除双链细胞和死亡细胞，然后排除CD45-细胞。在总粒细胞被CD15和CD66b门控之前，排除谱系细胞和

单核细胞。因此，在使用CD11b和CD16对中性粒细胞亚群进行经典命名之前，嗜酸性粒细胞被排除在外。

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Human中性粒细胞的门控策略。作为使用CD11bvsCD16的替代方法人脐带血中性粒细胞总数可分为CD11b-

中性粒细胞祖细胞和CD11b+中性粒细胞。增殖的CD11b+preNeus可以用CD101和CD49d进行分离，如前文所

示。如前所述，剩余的非增殖中性粒细胞池可以用CD10分离。

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二、小鼠骨髓嗜中性粒细胞

1、分步制样

(1)用手术刀分离股骨，使髋部球窝关节脱臼。分离连接胫骨的膝盖骨关节。

(2)清理肌肉组织，切断股骨球以形成一个开口。

(3)使用1mL注射器和含1mL洗涤缓冲液(PBS+2%FCS+2mMEDTA)的19号针头，将骨髓从开口冲洗到含有1mL

缓冲液的15mL隼管中。