分子生物学 第7章学习资料 .ppt

当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S,DNA结合激活RecA-p的proteinase活性LexA-p降解RecA-p高效表达300timesupSOSopen当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff7.3.2.5突变的形成DNADNAdamaged/mispairing物理诱变，化学诱变，自发突变未经修复死亡突变率降低经过修复/校正倾向差错修复避免差错修复（重组修复，SOS）形成突变（光修复，切补修复）不形成突变7.3.3.基因的回复突变(backmutation)7.3.3.1.回复突变的概念wildtypemutant(inphenotype)mutation(lowF.)backmutation(verylowF.)7.3.3.2.回复突变的分子机制a)AGC(Ser)?ACC(Thr)?AGC(Ser)b)AGC(Ser)?AGG(Arg)?AGT(Ser)c)AGC(Ser)?AGG(Arg)?AAG(Lys)ifSer≈Lysd)Intragenicsuppression(基因内抑制的回复突变)(基因内第二位点发生突变,使突变的蛋白酶的构型和活性又回复到野生型状态,从而使表型发生回复.)e.g.trp.A---UGG174----------GGA210---(w.t.)(lys)(Gly)backmutation(Cys)（Gly）----UGG174-----------GGA210--------UGG174----------GGA210--------UGC174-----------GAA210----活性结构无活性结构CA无活性结构(Lys)(Glu)如何用简单的遗传学方法区分核苷酸水平的回复突变和基因抑制的回复突变?NonsensesuppressortRNA负载氨基酸与反密码子识读秘密子的功能是彼此独立的TACUAGCGACTAe)Intergenicsuppression—1tRNA基因的反密码子MissensesuppressorIntergenicsuppression—2AGAUCUGlyArgGlyUCUCCUGGACCUGlyGly(基因间抑制的回复突变)Intergenicsuppresion-3(多聚体酶类构型的吻合)Subunit-1Subunit-2+ActiveformABabBackmutActiveformB+Inactiveform基因的定点诱变oligo-dNt介导的定点诱变合成与目标基因某区段互补并含突变位点的oligo-dNt错配位点不能在3‘-endrenaturationreplicationtwotimes两通用引物（commonP1commonP2）设计两突变引物（mut.P1mut.P2）第一次两种PCR产物混合，变性，复性其中一对双链分子不能进行第二次PCR另一对双链分子的PCR产物为诱变基因引物重叠延伸的PCR诱变cP1mP1mP2cP2DNAshuffling技术的基因诱变Mutants.Digestionligationtransformationselection插入突变体库的构建定向选择表型鉴定＋AIMS…定向选择表型鉴定＋gfp…转座子介导的突变体库的构建Ti质粒介导的突变体库的构建具有标签的植物突变体T-DNA-mediatedGenetrapLBGenetrapRB是经过改造的质粒