基于羧甲基壳聚糖和PEI的pH响应siRNA递送系统构建及生物活性评价.pdf

中文摘要

癌症作为当前威胁人类生命健康的主要杀手，其防治工作刻不容缓。近年来，

基因治疗在分子医学领域崭露头角，为精准治疗各种致命性疾病提供了可能。特别

是RNA干扰技术，通过诱导目标mRNA的降解以实现基因表达沉默，正受到学术

界的广泛关注。然而，RNA分子在体内易被核酸酶降解，这极大地限制了RNA药

物的治疗效果。为解决这一问题，研究者们致力于开发各种RNA递送载体，旨在

提高RNA药物在体内的稳定性和生物利用度。在众多递送载体中，聚合物纳米载

体因其出色的生物相容性和规模化生产潜力，已成为siRNA高效递送的重要工具。

PEIsiRNA

聚乙烯亚胺（）是一种阳离子聚合物，具有出色的络合能力和“质子海

绵效应”，因此在基因递送领域具有广泛的应用前景。然而，PEI严重的细胞毒性

PEI

限制了其在基因递送领域的应用。为此，各种生物相容性分子被用于对进行修

CMCS

饰，以提高递送效率，并降低其细胞毒性。羧甲基壳聚糖（）作为一种具有

良好生物相容性的聚合物，其独特的pH响应电荷反转特性使其在生物医学领域的

应用前景十分广阔。

pH

本课题基于以上研究背景，设计并构建了一种新型的响应电荷反转型

siPKM2纳米递送系统，以期为癌症治疗提供新的解决方案。该系统在弱酸性环境

下能有效保护siPKM2免受降解，并显著提高其递送效率。其在进入细胞后，通过

释放siPKM2分子，可有效下调PKM2的表达水平。这一机制为抗肿瘤治疗开辟了

新的途径，具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。本课题主要包括以下三个

方面的研究内容。

1CMCS/PEIsiRNA

（）复合物的构建、表征及对的络合性能研究。通过静电

相互作用，CMCS和PEI形成稳定的复合物，利用凝胶阻滞实验研究了该复合物对

siRNA的络合性能，并评价CMCS/PEI@siRNA纳米复合物的血清稳定性；通过

MTT法和红细胞溶血实验检测了CMCS/PEI复合物的细胞毒性和生物相容性。结果

表明：CMCS/PEI复合物可有效络合siRNA并改善其血清稳定性；CMCS可显著降

PEI对细胞的毒性作用以及对红细胞的溶血毒性，从而改善PEI的生物相容性。

2CMCS/PEI@siPKM2siPKM2

（）纳米复合物对的递送性能及基因沉默效率。

首先通过Westernblot技术证实：PKM2在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468中显著

I

高表达，因此采用该细胞进行后续研究。通过倒置荧光显微镜与流式细胞仪对

MDA-MB-468细胞摄取CMCS/PEI@siPKM2纳米复合物的情况进行检测，结果表

明CMCS/PEI@siPKM2纳米复合物在弱酸性条件下，其内化能力明显增强，从而显

著提高了siPKM2的递送效率。另外，通过荧光定量PCR和Westernblotting技术的

验证，我们发现在弱酸性环境下，CMCS/PEI@siPKM2纳米复合物能够有效下调

MDA-MB-468细胞中PKM2的表达。

（3）CMCS/PEI@siPKM2纳米复合物的抗肿瘤活性评价。通过MTT法、结晶

紫染色法、Calcein-AM/PI活死细胞双染法、AnnexinV-FITC/PI双染法、葡萄糖检

测、细胞划痕实验、Transwell实验、线粒体膜电位检测和线粒体凋亡相关蛋白Cyto

c和Caspase3检测等方法