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《基础生物学实验》精品课程《基础生物学实验》精品课程细菌染色技术PART1目的要求学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的染色法。初步认识细菌的形态特征。巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。微生物染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性紫复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料。微生物染色原理带正电荷的碱性染料染色部分很容易与带负电荷细菌细胞结合使细菌染色。而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷；在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；材料菌种染色剂仪器或其他用具：显微镜酒精灯载玻片接种环香柏油酒精+乙醚擦镜纸生理盐水等。简单染色方法涂片干燥固定染色水洗镜检干燥革兰氏染色菌种:参考菌：G+：Staphylococcusaureus,G-:Escherichiacoli仪器显微镜；材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较添加标题成分占细胞壁干重的%添加标题革蓝氏阳性菌革蓝氏阴性菌添加标题肽聚糖含量很高（50-90）含量很低（~10）添加标题磷壁酸含量较高（50）无添加标题类脂质一般无（2）含量较高（~20）添加标题蛋白质无含量较高革蓝氏染色的意义01细菌分类鉴定02指导临床用药微生物分类鉴定的特征添加标题形态学和生理生化特征添加标题核酸碱基组成和序列分析添加标题血清学实验和噬菌体分型添加标题氨基酸序列和蛋白质分析形态学特征培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表面特征、光泽等细胞形态：形状、大小、排列方式特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等细胞内涵物染色反应：革蓝氏染色、抗酸性染色运动性方法涂片初染媒染脱色复染镜检涂片要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色;注意练习无菌操作；在载玻片上滴半滴生理盐水；取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕迹即可；菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。复染滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G?)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。PARTONE革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌作业202X实验报告1、涂片取一块干净的载玻片平放在载玻片架上，在载玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）；无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许菌苔；将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。1干燥将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上，室温下自然干燥。3、固定手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，热固定细菌细胞。原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、使细菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。4、染色将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min草酸铵结晶紫染色约1min。《基础生物学实验》精品课程《基础生物学实验》精品课程