荧光定量PCR技术-讲座.ppt

内参基因反应条件优化单一特异性产物反应效率90%-110%目的基因反应条件优化单一特异性产物反应效率接近内参基因反应效率尽量高实时荧光定量PCR技术的

原理、应用及实践(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR基本原理Real-timeqPCR的定量原理Real-timeqPCR的检测方法Real-timeqPCR的基本概念Real-timeqPCR的解析方法Real-timeqPCR的计算方法Real-timeqPCR的定义Companyname实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。Real-timePCR仪ABI7500PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorT与普通PCR的比较S形曲线，具有平台效应终点检测法反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量定量原理Companyname理想的PCR反应：X=X0*2n实际的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率定量原理Companyname在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)Ct+logM(3)log(1+Ex)Ct=-logX0+logMCt=-klogX0+b定量原理Ct=-klogX0+b确定初始模板的浓度每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。real-timeqPCR

使确定模板初始数量成为可能实时荧光定量PCR中的三个概念*01扩增曲线(primarycurve)荧光阈值（threshold)CT值(CycleThreshold)0203123扩增曲线(primarycurve)荧光基团荧光检测元件扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光增长曲线图横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度荧光阈值（threshold)是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。阈值线原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段CT值(CycleThreshold)Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt值的特点：Companyname相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性检测方法非特异性荧光标记：SYBRGreenI特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：Molecularbeacon解析方法*标准曲线分析绝对定量和相对定量融解曲线分析213融解曲线分析Companyname将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)Tm值确认PCR反应的特异性融解曲线分析Companyname融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确Companyname初始模板量的对数与循环数（Ct值）呈线性关系，就可以制作