细胞破碎蛋白质复性和固液分离.ppt

悬浮液从进料管进入转鼓，固相颗粒在离心力场作用下受到离心力的加速沉降至转鼓内壁，沉降的颗粒在螺旋输送器叶片的推动下，从（直筒段）沉降区通过（锥段）干燥区至固相出口排出；经澄清的液相从溢流孔溢出。从而实现固、液相自动、连续的分离。可应用于脱水、浓缩、分级澄清等不同场合。管式工业用离心机

（--张家港华大离心机公司）刮刀卸料工业用离心机

（--张家港华大离心机公司）主电机带动套装的内外转鼓全速旋转，物料由进料管引入转鼓，在离心力作用下，液相物穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸装置抽走排出机外。固相物截留在内转鼓形成环形滤饼层。进料达到预定容积后停止进料，进一步分离，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，刮刀自动旋转，将固相物刮下经输料螺旋排出机外，然后自动洗网，开始下一个循环。二、微孔膜过滤根据流体各组分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程。切割分子量?MWCO微滤（0.1~10μm)：分离固体颗粒超滤（0.001~0.1μm)：浓缩大分子物质反渗透（0.001μm)：从小分子中脱除水分微孔膜过滤的3种方式：缺点：技术难以掌握，影响因素多；稳定性和重复性不好；膜堵塞问题难以解决！优点：容易做到封闭式操作，不受环境污染设备投资少，操作安全；加工量可大可小，十分方便；有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。优点：一定的选择性；细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程缺点：（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；通用性差，不易确定最佳条件；6、微波加热法机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：一般只适合对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和树胶等的天然植物机械破碎法与非机械破碎法的比较比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜碎片大小碎片细小细胞碎片较大内含物释放全部部分黏度高（核酸多）低（核酸少）时间，效率时间短，效率高时间长，效率低设备需专用设备不需专用设备通用性强差经济成本低成本高应用范围实验室，工业范围实验室范围基因工程细胞蛋白质克隆表达的产物没有活性，一级结构正确，立体构型错误，无生物学活性！——包涵体难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。第三节蛋白质复性病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构——包涵体SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies01包含体形成原因：02（比较复杂，目前尚不完全清楚。）03缺少某些协助因子（分子伴侣？？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。04应该考虑的事：05设法减少包含体的形成！减少包涵体形成的策略低重组菌的生长温度降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。供给丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、pH等。添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂010302蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。如何使包涵体的构型复原成正确状态？12分离包含体：对培养收集的细胞进行破碎(高压匀浆结合溶菌酶处理)，然后离心(5000~20000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。01洗涤：除去包涵体沉淀的脂类和膜蛋白，一般加去污剂（TritonX-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）