真核基因表达系统.ppt

(Promoter+ori)(PolyA)ori第63页，共97页，星期日，2025年，2月5日2）增强子许多来源于病毒的增强子在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力SV40enhancerRSVenhancerCMVenhancerLTRenhancer第64页，共97页，星期日，2025年，2月5日3）筛选标记胸苷激酶(tk)基因

Thymidinekinasegene二氢叶酸还原酶(dhfr)基因Dihydrofolatereductase,dhfr新霉素抗性基因neomycinresistancegene第65页，共97页，星期日，2025年，2月5日胸苷激酶(tk)基因tk+细胞中：胸苷(T)→胸苷一磷酸二氢叶酸二氢叶酸还原酶四氢叶酸dCTPdATPdTTP氨基喋呤(Aminopterin)tk阻断补加次黄嘌呤（Hypoxanthine）死亡存活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）HAT第66页，共97页，星期日，2025年，2月5日二氢叶酸还原酶基因筛选法原理携带外源基因的载体连接有dhfr基因，可以表达二氢叶酸还原酶以dhfr-细胞为受体:CHO细胞dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。若在培养基内加入甲氨蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量第67页，共97页，星期日，2025年，2月5日新霉素的类似物G418对原核、真核均有毒neo编码的酶可使G418灭活此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便新霉素抗性基因(neo)第68页，共97页，星期日，2025年，2月5日2）调控序列ARS：酵母复制起始区(点)酵母启动子：常用的有:PGK(磷酸甘油激酶)GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶）ADH1(醇脱氢酶)SUC(蔗糖酶)Apase(碱性磷酸酶)酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性第31页，共97页，星期日，2025年，2月5日3、类型(types)酵母克隆载体(yeastclonevector)：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如YIP、YRP、YEP酵母表达载体(yeastexpressionvector)：酵母克隆载体+酵母启动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)克隆大片段DNA，2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。第32页，共97页，星期日，2025年，2月5日（1）酵母克隆载体的构建酵母整合型质粒(yeastintegratedplasmid.Yip)细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低。酵母复制型质粒(Yeastreplicableplasmid,YRp)细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差酵母附加子型质粒,YEp：细菌质粒DNA+酵母标记基因(YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制第33页，共97页，星期日，2025年，2月5日酵母复制序列酵母2μM质粒第34页，共97页，星期日，2025年，2月5日（2）酵母表达载体特点：含酵母启动子穿梭载体(shuttlevector)：既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。种类：啤酒酵母表达载体毕赤酵母表达载体：分泌型表达载体非分泌型表达第35页，共97页，星期日，2025年，2月5日啤酒酵母表达载体第36页，共97页，星期日，2025年，2月5日毕赤酵母表达载体------整合型第37页，共97页，星期日，2025年，2月5日(3)酵母人工染色体（yeastartificial

chromosome,YAC)----克隆大片段D