细胞核和线粒体的分离和观察.pptVIP

?在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后，于37℃融化，经3～4次冻融周期，可使细胞破碎。等渗溶液：0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液细胞核与线粒体的分级分离初步了解细胞内各种成分的分离方法掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。010203一、实验目的二、实验原理细胞器分离基本步骤细胞破碎 1分离、纯化 2细胞器鉴定 30102030405超声波处理法高速组织捣碎机法化学裂介法杆状玻璃匀浆器法反复冻融法细胞破碎的方法二、实验原理匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。细胞破碎的注意事项：根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术010203离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。分离纯化的方法二、实验原理1根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。2优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。3缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复悬浮和离心加以纯化。②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。差速离心法密度梯度离心下次课讲分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。（也可使用罗丹明123或MitoTracker等荧光探针标记法等）细胞核：DNA——亚甲基蓝、甲苯胺蓝、Hoechst染料等细胞器的鉴定分析肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。称取肝组织1g，剪碎；用预冷的0.25mol／L蔗糖-0.05mol／LTris-HCI缓冲液，pH7.4（0.25mol／l蔗糖－0.003mol／l氯化钙）溶液洗涤数次。（一）细胞核的分离提取方法和步骤按每克肝加8ml-9ml预冷的0.25mol／L蔗糖－0.05m/LTris-HCI溶液，用高速组织匀浆器匀浆（已完成）01取一定量匀浆液，在0℃—4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨）——（因已事先匀浆，本步骤研磨次数和时间可缩短）02肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂片①,自然干燥.03滤液以2500rpm，离心15分钟；缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行下一步骤。?在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后，于37℃融化，经3～4次冻融周期，可使细胞破碎。等渗溶液：0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液*