细胞培养的污染及控制.ppt

细胞培养中污染来源主要有以下五条途径：不洁的动物组织标本、空气、清洗消毒、操作、血清01不洁的动物组织标本02很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。03第二节污染来源空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。4、操作操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等。05操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等。06操作者未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原体。03培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。04来自操作者的污染主要有以下几方面：01器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理。02血清市售血清灭菌不彻底，潜在病毒和支原体污染。细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌，以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响.培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。被洋葱佰克霍尔德菌污染（假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名）是细胞培养过程中最常见的一种，尤在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色小点，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。污染的鉴别细菌、真菌污染的检测：肉眼直接观察法、培养检查法和显微镜观察法肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48hr内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。321显微镜下观察01细菌污染大多数可以使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。02在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。03培养检察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养，24小时内可以获得结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。白色念珠菌污染造成支原体高污染率的原因：1.支原体大小0.1－0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）；

2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。

3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；

4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；

5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞；

7.已受污染的培养基、血清。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢