限制性酶切方式及连接.pptVIP

限制酶切方式及连接1限制酶切的方式1.1单酶切1.2双酶切1.3部分酶切1.4完全酶切1限制酶切的方式1.1单酶切若DNA样品是环状DNA分子，产生与识别序列（n）相同的DNA片段数。若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产生n+1个DNA片段。1.1单酶切酶切体系：13μLddH2O反应体系2μL10×buffer4μL底物DNA1μL限制酶总体积：20μL1限制酶切的方式酶切步骤：加样；摇匀，短时离心；反应1—3h；反应终止。65℃水浴10—15min011.2双酶切03环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数之和。04线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数加1.02用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。1限制酶切的方式双酶切可以在不同的反应系统中进行。最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温度，另一个酶切割；需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓度，另一个酶切割；第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA，再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。D双酶切在同一个反应系统中。011.3部分酶切02指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。03用途：当某种限制酶的多个识别序列之中有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。04为了解决这个问题，就需要用到部分酶切，以满足实验的需要。1限制酶切的方式限制酶切后的连接2.1DNAligase:能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNAligase重组体载体自连目的基因自连01具互补黏性末端之间的连接02具平末端之间的连接2.2DNA片段之间的连接5‘GGACTG-0HP-AATTCTGCAA-3’3’CCTGACTTAA-P0H-GACGTT-5’E.coRI切割E.coRI切割DNAligase5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’3’CCTGACTTAAGACGTT-5’E.coRI识别序列具互补黏性末端片段之间的连接结论：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制酶的识别序列。