质粒DNA的提取和鉴.pptVIP

实验1.2质粒DNA的提取方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。01概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理02质粒DNA的提取方法纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求01目的02掌握碱裂解法提取质粒的方法碱裂解法基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37℃过夜培养从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Amp），37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）030201一细菌培养与质粒扩增取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，10000r/min，4℃，90sec吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上2-3min3214二质粒提取加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min，12000r/min，离心10min，将上清液转至另一Eppendorf管中01向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置20-30min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体02用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥038.20-30μLTE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存）04酶切鉴定10μL溶液+10×内切酶缓冲液2μL+5～10U酶到一Eppendorf管37℃，1-2h加2μL的反应中止液。电泳：1.1％Agrosegel的制备2.上样3.电泳4.紫外灯下观察和拍照