T_SDVMA 002-2024 鸭甲肝病毒3 型荧光RT-PCR 检测技术.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/SDVMA002-2024

鸭甲肝病毒3型荧光RT-PCR检测技术

Real-timeRT-PCRfordetectionofduckhepatitisAvirustype3

2024-12-12发布

2024-12-12实施

山东省兽医协会发布

I

T/SDVMA002-2024

前言

本文件按照GB/T1/1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则起草。

本文件由山东省兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心)、青岛嘉智生物技术有限公司、青岛新牧至康生物技术有限公司、山东省农业科学院家禽研究所、山东新希望六和集团有限公司、青岛市即墨区畜牧业发展服务中心。

本文件主要起草人：兰邹然、秦立廷、魏笑笑、黄兵、马秀丽、王苗利、刘志杰、戴荣莲、李波、杨晓雪、赵鲁、陈婷、孙爱荣、孙伟、武梅、王秋珍、李晓菲、高绪慧。

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鸭甲肝病毒3型荧光RT-PCR检测技术

1范围

本文件规定了鸭甲肝病毒3型实验室诊断样品采集与处理，以及荧光RT-PCR检测方法。本文件适用于鸭甲肝病毒3型的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3.缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DHAV-3:鸭甲肝病毒3型病毒(duckhepatitisAvirustype3)

荧光RT-PCR:荧光反转录聚合酶链式反应(real-timereversetranscriptpolymerasechain

reaction)

Ct值：荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数(cyclethreshold)

RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)

4仪器设备和试剂耗材

4.1仪器设备

4.1.1荧光定量PCR扩增仪。

4.1.2生物安全柜。

4.1.3高速冷冻离心机。

4.1.4核酸提取仪。

4.1.5恒温培养箱。

4.1.6微量移液器。

4.2试剂耗材及实验参照物

除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。

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4.2.1氯仿：分析纯，常温保存。

4.2.2异丙醇：分析纯，使用前预冷至-20℃。4.2.3无RNA酶水。

4.2.4实时荧光RT-PCR反应液。

4.2.5阳性参照物(鸭甲肝病毒3型病毒)。

4.2.6阴性参照物(鸭肝脏组织)。

5采样和样品前处理

5.1样品采集

5.1.1活体及病死鸭采样：按NY/T541要求无菌采集发病鸭的肝脏组织。

5.1.2病毒培养物：取5.2.1中处理好的上清液经尿囊腔接种9日龄~11日龄鸭甲肝病毒3型病毒抗体阴性鸭胚，0.1mL/枚，共5枚。封口后置于37℃恒温培养箱继续孵化，每日照胚2次，记录鸭胚死亡情况，观察到第6天。收集接种后24h～96h的死亡鸭胚病毒培养物。

5.2样品前处理

5.2.1组织样品处理：取肝脏组织2g~10g,加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反复冻融2次~3次，8000r/min离心10min,取上清液200μL用于RNA提取。

5.2.2病毒培养物处理：无菌收集培养24h~96h的鸭胚尿囊液，-20℃保存备用。

6存放与运输

采集或处理的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存，需放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融。采集或处理的样品需要运输时，需冷链运输。

7RNA提取

7.1在100μL病料上清液中加入1mL裂解液，剧烈颠倒50次～100次，室温静置10min后，加入

200μL氯仿，上下颠倒50次~100次，室