肿瘤细胞培养.ppt

*胶原酶的消化方法：0.5mg／ml胶原酶处理，可在显微镜下观察，纤维细胞逐渐被除去为止。用Hanks液或培养基洗涤，除去附着细胞的酶，再进行接种和培养。癌细胞系的建立第30页，共80页，星期日，2025年，2月5日*注意：当肿瘤组织标本很小，不能用酶消化获取癌细胞时，可以用组织块法进行原代培养。癌组织中不可避免有已耗竭和坏死的细胞，在酶消化前，应尽可能清除，以免接种后很快溶解破坏，释放出影响癌细胞生长的有害物。癌细胞系的建立第31页，共80页，星期日，2025年，2月5日*3、接种细胞消化后制备的癌细胞，培养时应有足够的细胞密度，通常接种细胞浓度为5×105／ml，37℃培养。癌细胞系的建立第32页，共80页，星期日，2025年，2月5日*4、成纤维细胞过度生长的去除常采用机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法和密度梯度离心法等。用选择培养基、饲养层等方法可以克服其过度生长。癌细胞系的建立第33页，共80页，星期日，2025年，2月5日*将玻璃吸管前端在火焰上烧弯曲，用作除去成纤维细胞的工具。可在显微镜下直接刮除生长的成纤维细胞，也可事先在显微镜下对有成纤维细胞生长的单层培养瓶上做出标记，然后按标记刮除。刮除后，用培养液洗1~2次后，加入新培养液培养。如需要可多次刮除。（1）机械刮除法癌细胞系的建立第34页，共80页，星期日，2025年，2月5日*根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。（2）反复贴壁法癌细胞系的建立第35页，共80页，星期日，2025年，2月5日*待细胞生长达一定数量后用胰酶消化，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；取编号为A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A瓶中，置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B瓶中；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次。癌细胞系的建立第36页，共80页，星期日，2025年，2月5日*（3）消化排除法先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下观察和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。癌细胞系的建立第37页，共80页，星期日，2025年，2月5日*（4）胶原酶消化法本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下观察，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。癌细胞系的建立第38页，共80页，星期日，2025年，2月5日*（5）其它方法聚丙烯酰胺抑制成纤维细胞生长密度梯度离心等癌细胞系的建立第39页，共80页，星期日，2025年，2月5日*5、选择性培养基选择性培养基是针对特殊细胞生长的营养要求设计的。在癌细胞建系中，选择性培养基的应用是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细胞生长的关键技术改进。癌细胞系的建立第40页，共80页，星期日，2025年，2月5日*HITES选择培养基是一种改良RPMI-1640培养基，含有氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌激素、硒等成分。HITES培养基适合用于人小细胞肺癌建系。癌细胞系的建立第41页，共80页，星期日，2025年，2月5日*为了抑制成纤维细胞生长，在培养基中加入成纤维细胞的抗体或成纤维细胞代谢抑制成分，也可提高癌细胞系建系率。血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因此用低或无血清培养基为好。癌细胞系的建立第42页，共80页，星期日，2025年，2月5日*6、饲养层在培养器皿底部接种能形成接触性抑制的成纤维细胞饲养层，可以有利于癌细胞生长和抑制癌组织中正常成纤维细胞过度生长。如人胎小