chw实验六琼脂糖凝胶电泳.pdfVIP

2.实验原理（Experimentprinciple）

➢在pHpI时，分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，

分子带负电，在电泳时向正极移动

➢采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，

琼脂糖是半乳糖及其衍生物构成的中

性物质，从海洋植物中提取的。

优点：•操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；

•结构均匀，含水量大，样品不易扩散；

•无紫外吸收，过程中和结果可直接用紫外；

•电泳后区带易染色，便于观察；

➢在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的分

子泳动率出现较大的差异，从而达到分离片段检测

其大小的目的。

➢显色：当用低浓度的荧光嵌入溴化乙啶(Ethidium

bromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的条

带,从而可以确定片段在凝胶中的位置

溴化乙锭（EB）—：紫外光下桔红色荧光

影响迁移率的因素

➢的分子大小

➢琼脂糖浓度

➢分子的构象

➢电源电压

➢嵌入的存在

➢离子强度影响

不同浓度琼脂糖分离分子的范围

琼脂糖浓度（W/V,%）分离范围（kb）

0.35-60

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2-4

2.00.1-3

胶浓度越大，越适宜分离的越小

6xLoadingBuffer组成：

EDTA30mM

甘油（Glycerol）36%二甲苯青

二甲苯青（XyleneCyanol）0.035%

溴酚蓝

溴酚蓝（BromophenolBlue）0.05%

本节课使用的上样缓冲液是TAKARA公司的6xLoadingBuffer，含

有溴酚蓝和二甲苯蓝双指示剂系统。

a.溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色，约与300bp的条带电

泳速率相同；

b.二甲苯青（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，

在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢，