基因组学理论课 第三节 基因组分析策略和技术.pptx

生物信息与数据处理;1克隆;基因文库（geneticlibrary）：所有克隆到载体上的基因的集合形成基因文库（geneticlibrary）。一个理想的基因文库应包括一个生物体DNA中每个片段的拷贝。

基因组等价物（geneticequivalent）在这样一个完整的基因组文库中克隆的数目（用基因组的大小除以平均片段长度）称为基因组等价物（geneticequivalent）。

克隆过程的随机性使某些片段将被克隆多次而另一些可能在基因组等价物中并不出现。增加基因组文库中克隆的数量将增加任一给定DNA片段都至少含有其一个拷贝的可能性。具有4个或5个基因组等价物的文库平均每个DNA片段有4或5个拷贝，基因组任一特定部分有至少一个拷贝的可能性为95%。;分子克隆技术流程;;3cDNA文库（cDNAlibrary）

所有蛋白编码区域共有的特征是它们被核糖体翻译之前全转化成mRNA。

逆转录酶（reversetranscriptase）将mRNA转化成互补DNA（cDNA），然后克隆成为文库。

由于细胞通常只转录具有重要功能的基因的mRNA，所以展示cDNA文库往往可以抓住基因组的关键部分。

在任一类型的器官或细胞文库中，cDNA的相对丰度可以指示一个特定基因的表达量。;;4聚合酶链反应;背景知识;PCR反应系统;模板DNA;引物;四种磷酸脱氧核苷酸(dNTP);TaqDNA聚合酶;方法;;PCR反应－－退火;PCR反应－－引物延伸;PCR扩增－－30个循环;PCR结果－－

凝胶电泳;二DNA序列测定;;;2双脱氧链终止法对DNA多聚酶的要求;3第一代DNA自动测序;4Solexa测序原理;以边合成边测序为标志的新一代测序技术的代表

有四种测序平台：

Roche(454)GSFLXsequcncer

Illuminagenomeanalyzer(Solexa)

AppliedBiosystemsSOLiDsequencer

HeliScopeSequencer

?Solexa公司在2006年被Illumina公司以6.15亿美元的高价收购，并将Solexa测序仪命名为Illuminagenomeanalyzer。;1)添加接头：

利用物理方法将待测样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端加上接头;2).表面结合(ClusterStation)

Solexa测序时利用微注射系统将已经加过接头的待测片断和接头随机添加到玻璃FlowCell内，每一个FlowCell又被分成8条lane，每条Lane的内表面上能以共价键的形式随机固定单链接???序列和带接头的单链待测DNA片断。

;;3).桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA片断

在Flowcell内加入未被标记的dNTP和酶起始固相桥型扩增；所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面；通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片断。;

4).测序：加入DNA聚合酶和被荧光标记的dNTP和接头引物进行扩增，在每一个测序列簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从获得待测片段的序列信息。;三大规模测序的策略;2全基因组霰弹法与逐步克隆法;全基因组霰弹法;逐步克隆法;;BACbyBAC;两种大规模基因组测序策略的比较;

;A物理图谱的制作;a.物理图的种类;b序列标签位点（STS）作图;物理图谱构建的步骤;B大片段克隆的筛选－－BAC文库的构建;BAC克隆的筛选;“反应池”方法;延伸克隆的筛选－－指纹图谱（FPC）法;;;a随机测序;phred读取程序：

实现碱基识别和错误率估算，生成*.phd文件

phd2fasta转化程序：

将*.phd文件转化为FASTA格式的*.seq,*.seq.qual的文件

cross_match载体标记程序：

将*.seq文件中的载体顺序标记为X

phrap拼接程序：

拼接各短片段，并进行质量评估

consed校对程序：

查看拼接结