转录水平检测甲胎蛋白课件.pptVIP

第四次讨论课医学分子生物学医学分子生物学AFP的来源及生化特性AFP测定的临床意义从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测AFP的来源及生化特性甲种胎儿球蛋白（alpha-fetoprotein或α-fetoprotein,?AFP或afp）。AFP是啮齿类动物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。人类胚胎在宫内发育的第六周左右用双向扩散法即能测出AFP，到第13周左右可达到高峰，第16周后AFP的浓度迅速下降而白蛋白浓度上升。在人类胚胎中AFP最高浓度可达3—4mg/ml，但新生儿期其血清浓度约为10－50ug/ml，出生后第1周末用双向扩散法即不再能测出，然而用敏感的方法测定，证明AFP可持续存在于正常成人的血清中。?AFP的合成部位主要是在啮齿动物及人类胚胎的肝脏，但也可在卵黄囊及胃肠道等。人类的AFP属于α球蛋白，分子量约为64,000—72,000。此蛋白约有18种氨基酸组成，碳水化合物约占4%。AFP测定的临床意义医学分子生物学诊断原发性肝癌。检测AFP的含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一，由于肝癌的癌细胞能合成或分泌较多的AFP释放入血的缘故。正因为如此，医生们就把检测人体血液中的AFP作为诊断肝癌的重要依据，并把AFP称为“肝癌标志物”。检测AFP是诊断肝癌的一种简便、灵敏、快捷的方法，现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值，用AFP诊断肝癌的“专一性”仅次于病理学检查。血清AFP升高，还可出现于畸胎瘤、睾丸和卵巢肿瘤等。急性肝炎和肝硬化的鉴别诊断肝细胞再生时期，AFP在血液中呈阳性，急、慢性肝炎、肝硬化时会有肝细胞再生，因而AFP在血液中的浓度升高。一般急性肝病，可随病情好转AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持续低水平，肝癌则逐渐上升。先天性疾病的诊断先天性疾病的诊断：检测羊水中AFP含量的意义已引起注意，Rendle用放射免疫法检测，发现无脑儿羊水中含量显着升高。正常妊娠12～16周羊水AFP含量为21.1±1.2mg/L，以后逐月下降，足月时为0.5±0.2mg/L。无脑儿患者在妊娠26～31周为95.7±19.3mg/L，32-38周为25.7±5.9mg/L。先天性肾病及脊柱裂也有类似报道。因此用放免法检测羊水中AFP含量，有助于某些先天性疾病的出生前诊断。母体血中AFP升高还可见于异常妊娠，如：胎儿有脊柱裂、无脑儿、脑积水、十二脂肠和食道闭锁、肾变性、胎儿宫内窒息、先兆流产和双胎等。实验方法及原理医学分子生物学从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测技术路线甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关。实验目的可能的结果分析及应用实验目的1技术路线2实验方法及原理3可能的结果分析及应用4肝癌细胞的血源性播散是原发性肝癌肝外转移的主要方式，定量检测AFP(alpha—fetoprotein)mRNA可早期发现外周血的肝癌细胞，不仅对判断肝癌的转移、复发具有重要价值，而且对指导临床制定治疗措施亦有重要意义。通过提取肝癌病人的外周血，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测。取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌性肝病患者作为对照组。5技术路线实验方法及原理实验目的可能的结果分析及应用通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，利用实时荧光定量PCR技术，测定AFPmRNA的丰度。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。一、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）医学分子生物学技术路线实验方法及原理实验目的可能的结果分析及应用01荧光染料02荧光共振能量转移03PCR扩增及其监测04实时荧光定量PCR定量原理05实时荧光定量PCR优缺点技术路线实验方法及原理实验目的可能的结果分析及应用荧光基团通常各有单一的的光吸收峰，荧光基团吸收激发光的能量后通常以3种方式释放出能量。（1）光能（2）热能（3）转移给邻近的分子01荧光染料技术路线实验方法及原理实验目的可能的结果分析及应用当某个荧光基团的发射光谱