肿瘤细胞培养技术.ppt

免疫方法3.弱免疫原免疫方案；0天：基础免疫30天：基础免疫45天：基础免疫60天：基础免疫75天：基础免疫6个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉或脾内追加免疫后72~96h细胞融合。第30页，共49页，星期日，2025年，2月5日免疫方法4.体外免疫：分离小鼠脾细胞，置10%~20%FCSRPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原（可溶性抗原0.5~5?g/ml；细胞性抗原105~106/ml），37℃，5%CO2培养3天，再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。第31页，共49页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体制备一.滋养细胞制备：1.机制：不明，通常认为这类细胞释放一种或几种生长因子，提供必要生长条件。2.小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞⑴正常无感染BALB/C小鼠，处死。⑵75%乙醇浸泡5~10min，第32页，共49页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体制备⑶撕开腹部皮肤，充分暴露腹腔，提起腹膜，剪开，吸管注入5ml无血清培基，小心提动或轻揉腹膜，吸出培基。⑷无血清培基洗2次，细胞浓度2×105/ml,0.1ml/孔/96孔，相当于2×104。通常获2×106~5×106只。第33页，共49页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体制备二.骨髓瘤细胞准备：Sp2/0,NS-1等1.复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。2.培养、传代，取对数生长期细胞（1×105~5×105/ml），按1：5~1：10稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。3.RPMI-1640培基洗3次（1000r/min×5min)第34页，共49页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体制备注意事项：1.骨髓瘤细胞的细胞活数应在〉95%，2.无各种污染，3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。第35页，共49页，星期日，2025年，2月5日第1页，共49页，星期日，2025年，2月5日Histroy肿瘤类型：间充质上皮神经外胚层造血源性（1955-1958-1963-1965）Invitro:原代传代建系（1967-1970）配基成分：纯血清含血清无血清生物学特性：细胞亚细胞酶和分子第2页，共49页，星期日，2025年，2月5日肿瘤细胞invitro的特点细胞保持永生性：自我复制形态学：大小不一?逐渐一致增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50%突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化变低分化表面性状：负电荷数量正常，贴壁性?，抗原性可变异接触抑制减弱或消失：悬浮生长特征：成瘤性：移植到动物体内可成瘤第3页，共49页，星期日，2025年，2月5日肿瘤细胞invitro培基RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮性或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12：适用于上皮性癌，如肝癌，L-15：注意：+2g/LNaHco3或+20mmol/LHEPES?pH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤第4页，共49页，星期日，2025年，2月5日培养液特殊添加剂常用的促细胞生长因子及使用的终浓度添加剂终浓度添加剂终浓度BSA10-5mol/mlEGF5ng/mltransferrin5-10?g/mlFGF5ng/mlinsulin5