拟南芥中ROXY-bHLH互作模块鉴定及在根生长发育中的功能分析.pdf

摘要

ROXY1编码一个谷氧还蛋白（glutaredoxin），其在花发育和根生长过程中均发

挥重要作用。前期研究发现ROXY1与bHLH74互作，共同参与拟南芥根的生长。

bHLH74属于XII亚家族，由16个基因组成。除bHLH74外，ROXY1是否还与这

个亚家族其它的bHLHs互作并参与拟南芥根的生长发育调控？另外，拟南芥中有

21个ROXY家族成员，除ROXY1外，其它成员是否也与bHLH74互作？为了验证

ROXY-bHLH这个互作模块以及其生物学功能，我们进行了双分子荧光互补实验

（BiFC）、表达模式分析、突变体表型分析及下游基因表达分析，本文主要研究结

果如下：

1．利用BiFC验证了ROXY与bHLH这一模块各成员之间的相互作用。

ROXY1除与bHLH74互作外，还与bHLH49、bHLH76、bHLH77和bHLH79互

作；ROXY2/3/4/5/18/19/20分别与bHLH49、bHLH74、bHLH76、bHLH77和

bHLH79互作；除ROXY20与对照组bHLH68（X亚家族）互作外，其余验证的

ROXYs均不与bHLH68互作；XII家族的bHLHs成员均会自身形成同源二聚体，

也可在bHLHs之间形成异源二聚体。

2．采用RT-PCR和报告基因（GUS和GFP）分析了多个ROXYs与bHLHs基因

的表达模式、启动子活动部位及其蛋白分布。RT-PCR结果显示ROXY2在所有检测

的组织中均表达，且根中表达量较高；ROXY3不在根中表达，而在其它组织中均有

表达；ROXY4/5也在所有组织中表达，而叶中表达量相对较高；ROXY18不在果荚

中表达，叶中表达相对较高；ROXY19/20在所有组织中均有表达，而在茎和叶中表

达量相对较高。bHLH49/76/77/79在所有检测的组织中均表达，而除bHLH79外，

bHLH49/76/77均在根中有较高表达水平。对报告基因转基因植物观察结果分析表

明：ROXY2蛋白在花药绒毡层、维管束、叶脉及根尖表达。ROXY3启动子在花

托、萼片、花丝以及子叶中活动，而根中未见活动迹象；其蛋白在萼片、子叶中表

达，根中未表达。ROXY4启动子在萼片、花药、生长锥以及子叶、根的维管束中活

动；其蛋白同样在叶脉、根的维管束中表达。ROXY5启动子在萼片、花托、根的维

管束、子叶中活动；其蛋白在萼片以及根的维管束中表达。ROXY18启动子在花

柱、花托、幼苗及根尖均活动。ROXY19蛋白在根尖表达。ROXY20启动子在幼苗

的生长锥、根尖及侧根活动；其蛋白在根尖及侧根表达。bHLH49启动子在柱头、

I

花柱、花托、幼苗、根尖及侧根活动；其蛋白在根尖及侧根表达。bHLH76启动子

在花柱、幼苗的生长锥及根部活动；其蛋白在根尖及侧根表达。bHLH77蛋白在根

尖及侧根，而bHLH79蛋白在叶片、根尖、侧根及幼苗的生长锥表达。这些表达分

析结果表明：除ROXY3不在根中表达外，其它基因包括ROXY2/4/5/18/19/20和

bHLH49/76/77/79均在根中表达，且有表达重叠部位，推测它们在根中可能共同发

挥作用。

3．为了探究ROXY-bHLH这个扩展的互作模块是否参与根的生长发育，我们

首先对bHLH相关基因的T-DNA突变体和CRISPR-cas9技术创制的突变体进行了

分析，并通过杂交获得了多突变体。研究发现三突变体bhlh74-1bhlh49bhlh76、

bhlh74-1bhlh49bhlh77、bhlh74-1bhlh49bhlh79均比双突变体bhlh74-1bhlh49根的

长度要短且有显著性差异。表明bHLH49、bHLH74、bHLH76、bHLH77和bHLH79

共同参与拟南芥根的发育。除已