实验五人淋巴细胞的培养.j.pptVIP

实验五人类淋巴细胞株培养——培养基的配制一、实验目的熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法。二、实验原理细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。010201L-谷氨酰胺氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。仪器三、仪器、材料和试剂超净工作台高压灭菌锅多重蒸馏水器磁力搅拌器天平微量加样器（二）用具、材料细胞培养瓶量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸pH试纸微孔过滤器（0.22μm）及注射器各种规格的Tip、离心管01020304NaOH、酚红RPMI1640干粉小牛血清、青霉素、链霉素NaHCO3、L-谷氨酰胺05三蒸水（三）试剂要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。01注意02四、实验步骤（一）准备(清洗与灭菌）（二）合成培养基的配制1.1%酚红：配制0.1mol/LNaOH100ml。称量1g酚红于研钵中，取30ml0.1mol/LNaOH逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。过滤后的酚红液加三蒸水至100ml。4℃保存。称取10g的NaHCO3溶于200ml三蒸水中，灭菌后分装于50ml试剂瓶。14℃保存。22.饱和NaHCO3的配制：配制50mlRPMI1640培养液：每组称取RPMI1640干粉0.52g，溶于50ml的三蒸水。置于搅拌器上搅拌20min，直到液体变为澄清为止。磁珠01023．RPMI1640培养液配制：4.RPMI1640合成培养基配制：加入0.1ml1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。配制好的培养基，用时用饱和NaHCO3液调节pH至。瓶口封好，-20℃或4℃贮存。处理后的血清贮存于4℃。新买的新生小牛血清一定要灭活。将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中56℃，30min，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。（三）小牛血清的处理*