实验2研究生PCR产物鉴定及PCR原理应用.pptVIP

94℃30s℃45s℃1min94℃5min×30次72℃7min4℃forever12345经典循环参数（500bp以内）PCR技术的特点灵敏度高30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性强引物序列与模板结合的特异性快速简便一次性加好反应液，2～4小时即可完成扩增PCR的应用领域生物学基础研究目的基因扩增和鉴定、DNA测序、定点突变医学临床应用遗传疾病基因诊断、致病病原体检测、组织配型人类基因组工程遗传图谱的构建、DNA测序、表达图谱法医学物证鉴定个体识别、亲子鉴定其他……动植物检疫、系统进化研究、分子考古学PCR技术应用于科学研究基因片段重组DNA分子克隆（目的基因的获取和鉴定）质粒DNA5’015’02BamHI03EcoRI04BamHI05EcoRI06PCR(5’端引入限制酶识别位点)07PCR技术应用于科学研究围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR－缺失突变）YangX（杨霞）,etal.JCellMolMed(IF:5.2),2010.A正常人A’020405内源性病变基因临床基因诊断病人030601PCR技术应用于临床诊断遗传疾病的基因诊断基因缺失、插入或置换等珠蛋白链合成不平衡地中海贫血A正常人病人正常病人A’01病原微生物基因02正常人(-)03病人(+)登革病毒的检测DMD：人类肌营养不良基因”A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失01030204PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析)限制性内切酶Ras癌基因A突变限制性内切酶B正常突变电泳个体识别；亲子鉴定方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性）DNA指纹PCR-ASO（等位基因特异性寡核苷酸）PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性PCR-STR（短串联重复序列）多态性PCR-SSCP（单链构象多态性）线粒体DNA测序PCR技术应用于法医学鉴定女性01男性02Y引物03PCR04男性女性05性别鉴定PCR技术应用于法医学鉴定logoPCR-STR(shorttandemrepeat)多态性检测PCR；电泳检测PCR技术应用于法医学鉴定个体识别现场血迹嫌疑人1嫌疑人2嫌疑人301父’父子母02亲子鉴定PCR技术应用于法医学鉴定1：Marker2：阳性模板3：待测样品14：已确诊乙肝病人样品5:待测样品26:待测样品37:阳性模板结果分析阴性阴性乙肝病毒基因携带者PCR；电泳检测PCR-VNTR(VariablenumbleoftandemlyrepeatedshortDNAsequence)多态性检测3’VNTR位于该基因3’端下游第2个PolyA信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（minisatellite）。根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种ApoB基因3’VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在400～1200bp之间.根据重复序列的内部结构分为两类：ATAATTAAATATTTT，称为X型；ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T），又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。apoB?3‘VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成。有关3’VNTR多态性2熟悉apoB基因多态性的基本原理和操作步骤3了解PCR技术的广泛应用1掌握PCR技术的原理及基本步骤小