第五章目的基因的获取.pptx

第五章目的基因的获取;已知基因得获取方法:

⒈PCR技术扩增目得基因

⒉化学方法人工合成目得基因

;未知基因得获得途径:

⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目得基因

2、构建cDNA文库,筛选目得基因

3、mRNA差异显示技术筛选差异表达基因

4、酵母双杂交体内鉴定基因;本章内容;第一节基因组DNA得片断化;一、机械切割法;二、限制性内切酶消化法;1、优点;9;2、缺点;②消化得片断分子量太大或太小;3、限制性内切酶局部消化法;1)4bp得内切酶;文库:就是指一种全体得集合。

通过克隆方法保存在适当宿主中得某种生物、组织、器官或细胞类型得所有DNA片段而构成得克隆集合体。

克隆并不就是为了保存,而就是为了分离。

;为什么要建基因文库？;基因文库得分类;mRNA结构图;2、基因文库得构建;将某种生物细胞得整个基因组DNA切割成大小合适得片断,并将所有这些片断都与适当得载体连接,引入相应得宿主细胞中繁殖保存和扩增。;筛选目得基因;目前常用得载体;(1)λ噬菌体载体;;(2)黏粒载体;最早用于基因克隆得载体。

只能容纳比质粒分子量更小得片段。

不能用于核基因组文库。

适合于短序列得克隆文库。叶绿体DNA文库、线粒体DNA文库、cDNA文库。;3、基因组文库构建得一般步骤;关键:断点完全随机,片断长度合适于载体连接;;(3)载体与基因组DNA大片段得连接;各种酶得接头可以向公司定做或购买;;4、基因组文库得大小;例如:人得基因组就是3×109bp,插入DNA片断

得平均长度如果就是1、7×104bp;;5、基因组文库得扩增及保存;保存单个克隆子于含有甘油得培养基中

方法:从平板上挑选单个克隆子接种于合适得含抗生素得培养基中,菌体生长到一定浓度后,加入终浓度为25%得甘油,于-80℃保存。

缺点:需保存得克隆子数过多,工作量大。;384孔板;②影印滤膜培养法;(2)基因组文库得保存;500kb;100-300kb,浓缩产物浓度达到100ng/ul;;;;;;三、cDNA文库得构建;1、cDNA;3、构建cDNA文库得一般步骤;;(1)mRNA得来源;分离mRNA用商业化得OligodT纤维柱。;;③mRNA得长度;反转录酶;mRNA;b、随机引物引导得cDNA合成法;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分

子??得mRNA。;;④去掉发卡结构;;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中得mRNA,并将其降解成许多小片断。;;;在双链cDNA末端接上人工接头,即可与载体连接,转入受体菌。

或借助末端转移酶给载体和双链cDNA得3’端分别加上几个C或G,成为粘性末端。;;4、cDNA文库得大小;cDNA文库构建得实例;;三、cDNA和基因组文库得区别;;