《猪瘟和猪丹毒鉴别》课件 .ppt

*************************************猪瘟病毒分离样品处理首先将采集的组织样品（扁桃体、脾脏或淋巴结）制备成10%的组织悬浮液。具体方法是将组织切成小块，加入适量PBS缓冲液，在匀浆器中充分研磨，然后离心去除组织碎片，取上清液。上清液可直接用于接种，也可通过0.22μm过滤器过滤以除去细菌和真菌等杂质。细胞培养猪瘟病毒分离通常使用PK-15（猪肾）细胞系。将处理好的样品上清液接种到单层PK-15细胞中，接种量为细胞培养液的5-10%。接种后在37℃、5%CO?条件下培养，每天观察细胞病变效应（CPE）。猪瘟病毒通常不引起明显CPE，因此需要通过荧光抗体染色或PCR确认。病毒鉴定培养48-72小时后，收获细胞和培养液，通过免疫荧光染色（IFA）、免疫过氧化物酶染色（IHC）或PCR检测来确认病毒分离情况。如首次培养阴性，可进行盲传（将培养物接种到新的细胞中），增加分离的成功率。如PCR阳性但分离阴性，可能是样品中病毒量过低或病毒已失活。猪丹毒细菌培养培养基选择猪丹毒杆菌的分离培养通常使用血液琼脂平板和肉汤培养基。血液琼脂平板适用于初次分离和观察菌落形态，通常使用含5%羊血或马血的血平板。肉汤培养基（如胰蛋白胨大豆肉汤）适用于增菌培养，特别是菌量较少的样品。对于污染严重的样品，可使用选择性培养基如Packer培养基或添加叠氮钠的培养基。培养条件将处理好的样品（心血或组织匀浆上清）接种到培养基上，在37℃条件下培养24-48小时。猪丹毒杆菌对氧气需求不严格，可在需氧或微需氧条件下生长。为提高分离率，可同时进行需氧和微需氧培养。培养24小时后观察菌落形态，必要时继续培养至48小时。对于混合感染或污染样品，可采用划线分离法获得纯培养。菌落特征猪丹毒杆菌在血平板上形成的菌落具有典型特征。24小时培养后，菌落呈细小（直径约0.5-1.0mm）、透明或半透明、圆形、光滑边缘，呈α溶血（部分溶血，产生绿色区域）。菌落常呈露珠样外观，在斜射光下观察更为明显。革兰氏染色可见细长的革兰氏阳性杆菌，呈单个、成对或短链状排列。这些特征性表现是猪丹毒杆菌初步鉴定的重要依据。猪瘟PCR检测PCR检测是目前猪瘟诊断最常用的方法，具有快速、灵敏和特异的优点。检测过程首先需要从样品中提取总RNA，常用方法包括TRIzol试剂法、硅胶柱法或磁珠法。提取的RNA需经过逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增。针对猪瘟病毒的PCR引物通常设计在病毒基因组的保守区域，如5非编码区（5UTR）或NS5B基因区。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）因其速度快、灵敏度高和污染风险低等优势，已成为猪瘟诊断的主要方法。qRT-PCR可在3-4小时内完成检测，灵敏度可达到5-10个病毒拷贝，且能够进行定量分析，评估样品中的病毒载量。对于需要进一步分型或毒力分析的样本，可进行病毒基因的测序分析，特别是E2基因区，它与病毒的抗原性和毒力密切相关。PCR检测结果的解释需结合临床表现、流行病学情况和其他实验室检测结果综合判断。猪丹毒PCR检测1核酸提取猪丹毒PCR检测首先需要从样品中提取细菌DNA。常用的提取方法包括煮沸法、酚-氯仿法和商业试剂盒法。对于纯培养物，可采用简便的煮沸法；对于组织样品，建议使用商业DNA提取试剂盒，以获得更纯净的DNA模板。提取过程中应加入适当的阳性和阴性对照，确保提取过程的有效性。2引物设计猪丹毒PCR检测的引物通常针对细菌特异性基因区域设计，常用的靶基因包括23SrRNA基因、SpaA基因（表面保护抗原）和Ery基因（溶血素基因）等。这些基因在猪丹毒杆菌中高度保守，且与其他菌种有足够的序列差异，确保检测的特异性。引物设计时需考虑特异性、扩增效率和产物大小等因素。3PCR反应PCR反应体系通常包括模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。扩增条件一般为：94℃初始变性5分钟，然后进行30-35个循环（94℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30-60秒），最后72℃延伸10分钟。实时荧光PCR已广泛应用于猪丹毒的快速诊断，可在1-2小时内完成检测，且灵敏度和特异性更高。猪瘟血清学检测ELISA方法检测抗体的高效特异方法1结果判读基于OD值比较确定阳性/阴性2应用场景适用于群体免疫监测和疫情调查3ELISA是猪瘟血清学诊断最常用的方法，分为间接ELISA和阻断ELISA两种。间接ELISA通过检测样品中的总抗体量来判断是否阳性，而阻断ELISA则通过检测样品抗体对特定抗原-抗体结合的阻断效果来判断。目前，E2蛋白阻断ELISA因其能够区分野毒感染和疫苗