酶免疫组化实验.ppt

第1页，共22页，星期日，2025年，2月5日实验目的1、掌握免疫组化技术的基本原理。2、掌握检测T细胞表面分子CD3的实验原理及检测方法。3、掌握SABC免疫放大技术原理。第2页，共22页，星期日，2025年，2月5日免疫组织化学技术（immunohistochemistrytechnique,IHCT）是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物，对抗原抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。抗原抗体反应的特异性组织化学的可见性第3页，共22页，星期日，2025年，2月5日分类酶免疫组化技术荧光免疫组化技术亲和免疫细胞组化技术免疫金（银）细胞染色组化技术免疫标记电镜技术杂交免疫细胞组化技术第4页，共22页，星期日，2025年，2月5日酶免疫组化技术酶免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在与否或定位的一类酶免疫技术。本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例。以亲和素-生物素-过氧化物酶（ABC或SABC）技术检测T淋巴细胞亚群为例验证酶免疫组织化学技术检测组织抗原的方法。第5页，共22页，星期日，2025年，2月5日酶免疫组化染色中常用的酶及显示底物最常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）常用的供氢体：二氨基联苯胺（DAB）—反应产物呈棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）—反应产物呈橘红色4-氯-1-萘酚—反应产物呈灰蓝色第6页，共22页，星期日，2025年，2月5日生物素-亲和素放大技术是一种以生物素(biotin，B)和亲和素(avidin，AV)具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记，与标记免疫技术的有机结合，极大提高了分析测定的灵敏度。特点：灵敏度、特异性、稳定性、适用性常见类型：BAB法和ABC法第7页，共22页，星期日，2025年，2月5日ABC法原理1、预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物结合，形成可溶的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。2、当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，ABC（或SABC）中未饱和的亲和素结合部位就可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应与ABC（或SABC）标记体系连成一体进行检测。第8页，共22页，星期日，2025年，2月5日优点一个亲和素（A）有4个生物素结合位点，一个过氧化物酶可结合多个生物素分子，ABC法将亲和素作为“桥”把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，形成一个网络状复合物，其中网络了大量酶分子，因此应用于检测体系时，极大提高酶在抗原-抗体反应中的浓度，提高检测敏感性。第9页，共22页，星期日，2025年，2月5日实验原理将分离得到的淋巴细胞制成涂片，加入的CD3单克隆抗体与待检单个核细胞涂片作用。CD3阳性的细胞就会与CD3单克隆抗体特异性结合，再用生物素化抗鼠IgG检测CD3单抗与待检细胞结合的情况。最后加入链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(ABC桥联法)，与生物素化抗鼠IgG结合，酶遇到底物时，能催化底物产生有色不溶性产物。根据细胞被底物着色的情况可以判定CD3阴性和阳性的细胞，测定其阳性百分率。第10页，共22页，星期日，2025年，2月5日SABCB-山羊抗鼠IgG抗体鼠抗CD3单抗CD3T淋巴细胞间接ABC法：CD3——鼠抗CD3单抗——B-山羊抗鼠IgG抗体——SABC第11页，共22页，星期日，2025年，2月5日实验器材与试剂1、5%BSA2、抗CD3单克隆抗体3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗)4、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)5、3,3,-二氨基联苯胺(DAB)6、0.0lmol/LpH7.2PBS7、淋巴细胞分离液8、丙酮9、玻片、吸水纸、显微镜等第12页，共22页，星期日，2025年，2月5日实验步骤1、无菌采集静脉血3ml/2人，注入盛有肝素的无菌试管中（肝素浓度为20U/ml全血），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。2、用无菌吸管加入等体积即3ml的室温PBS液，使血液等倍稀释。第13页，共22页，星期日，2025年，2月5日3、取10ml试管2支，分别加入1.5ml淋巴细胞分离液（Ficoll），将离心管倾斜45?角，在距分层液界面上1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管3ml，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。第14页，共22页，星期日，2025