第七章 核酸的分子杂交教学课件.ppt

缺口平移法标记DNA探针DNaseⅠ；Mg2+53模板DNA35533随机打开缺口5DNA聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs标记的探针随机引物法标记DNA探针53模板DNA3553变性53Klenow聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs变性标记的探针随机引物1、乙醇沉淀法2、SephadexG-50柱层析法3、微柱离心法（四）探针的纯化小结在核酸分子杂交反应中，单链DNA或RNA互相随机碰撞，在严格的杂交条件下，只有核酸顺序几乎完全互补的两条链才能配对形成“杂交”双链。由于杂交反应的高度特异性，杂交体系中任何单链核酸都可以用放射性核素或化学试剂标记成探针来寻找互补链，这种类型的探针广泛用于检测与特异性基因相一致的核酸。如果杂交条件不严格，从一个基因来源的探针可能与相似的基因杂交，这是寻找基因家族成员的较好方法。总之，核酸分子杂交是分子生物学和生命科学其它领域应用最广泛的技术。重点掌握：核酸分子杂交的概念、原理、种类；探针的种类、标记的方法重点掌握：核酸分子杂交的概念原理种类：1.Southern印迹杂交探针的种类标记的方法：1.缺口平移法2.随机引物法3.PCR标记法4.末端标记法2.Northern印迹杂交3.斑点及狭缝印迹杂交4.原位杂交5.液相杂交第七章核酸的分子杂交一、核酸分子杂交的概念三、核酸分子杂交的原理四、核酸分子杂交的过程五、影响杂交的因素六、核酸分子杂交的基本方法二、核酸分子杂交的用途核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。一、核酸分子杂交的概念DNA—DNA杂交分子DNA—RNA杂交分子核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。用途：1、是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的有力工具；2、在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或cDNA探针进行菌落杂交，可从cDNA文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；3、用克隆化的DNA片段作探针进行Southern杂交，可确定基因组DNA上特定区域的核苷酸同源顺序；二、核酸分子杂交的的用途4、用S1核酸酶或RNA酶消化DNA/RNA或者RNA/RNA杂交体是分析基因转录或RNA加工的重要方法；5、对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行染色体定位；6、可用于遗传病的基因诊断，用于限制性片段长度多态性作疾病的相关分析，基因连锁分析，法医学上的性别分析和亲子鉴定。7、在人类学研究中，HLA分型等方面也有应用价值。核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针（probe），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。三、核酸分子杂交的原理探针的意义：要检测某一样品或基因组DNA中特定的DNA顺序或基因片段，首先必须获得相应的探针，即已知顺序的DNA或RNA片段，并使它带上可检测到的示踪标记。分子杂交的形式：⑴固—液相杂交一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸固定在适当的载体上，然后置于含相应单链核酸探针的杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序的存在与否及分子量大小。⑵液相杂交有时也将待测核酸和已知核酸同时放在液体中进行杂交反应。两种杂交形式的基本原理都是一样的。1、变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响，称为DNA