分子生物学PCR课件.pptx

PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应;PCR技术是一个体外模拟体内DNA复制过程核酸扩增技术。它是以待扩增双链DNA为模板，以一对人工合成寡核苷酸为引物，以四种dNTP为底物，经过耐高温DNA聚合酶酶促作用，经过“变性、退火、延伸”三步反应循环快速特异地扩增出特定DNA片断。

;PCR技术基本原理;模板DNA;;引物1;第1轮结束;;;模板DNA;PCR反应动力学;PCR扩增体系;PCR反应体系;引物;设计引物应遵照以下标准：

①引物长度：

15-30bp，惯用为20-27bp左右。在做长片段PCR或做一些特殊PCR时应使用较长引物，但最多不超出50个核苷酸。

②引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，过高或过低均不利于引发。ATGC最好随机分布，防止聚嘌呤或嘧啶核苷酸。

③防止引物本身互补，形成发夹结构，因空间位阻而影响其与模板结合。两条引物间之间也不能互补，不然会形成引物二聚体，产生非特异扩增条带或降低引物有效浓度。

;④引物3’端碱基，应严格要求配对，不可修饰，以防止因末端碱基不配对而造成PCR失败。考虑到密码子简并性，引物3′端不终止于密码子第三个碱基。因该位置因为密码子简并性影响扩增特异性。

引物5‘端能够修饰，它对扩增特异性影响不大。如增加酶切位点；标识生物素、荧光、地高辛等；引入点突变、开启子序列等。

⑤引物特异性：

引物应该与核酸序列数据库其它序列无显著同源性，以降低引物与基因组非特异性结合。;简并引物

;比如，

序列1：tgaatgcatgcatgc

序列2：tgcatgcatgcatgc

序列3：tgtatgcatgcatgc

若样品并不能明确是1，2还是3，为了能从不确定序列起源样本中，扩增出同源序列来，你引物实际上就是针对序列1，2，3设计混合物。这么不论是1，2还是3，采取你引物均能有效扩增。

;套嵌引物;引物溶解与保留：;DNA聚合酶;③Taq酶功效缺点;1.不一样企业或不一样批次产品常有很大差异，因为酶浓度对PCR反应影响极大，所以应该作预试验或使用厂家推荐浓度。

2.浓度过高可引发非特异性扩增，浓度过低则合成产物量降低.;底物：dNTP;模板(靶基因);模板种类：DNA或RNA。

1.RNA：先经过反转录得到cDNA。

2.质粒：线性化比环状效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。

3.高分子量脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核酸）做模板时，假如用适当酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更加好。

;Mg2+;PCR反应条件选择

;①变性温度与时间：;②退火温度与时间：;③延伸温度与时间;④循环次数;PCR扩增产物分析;2.酶切分析：依据PCR产物中限制性内切酶位点，用对应酶切、电泳分离后，取得符合理论片段，此法既能进行产物判定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

3.分子杂交：如Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链，标识后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性判定，还可知其分子量。

4.斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，观察有没有着色斑点，主要用于PCR产物特异性判定及变异分析。

5.核酸序列分析：是检测PCR产物特异性最可靠方法。;★设定对照;PCR反应关键步骤有:

①模板制备，

②引物质量与特异性，

③酶质量及活性

④PCR循环条件;1、PCR常见问题：

出现非特异性扩增带

无特异性扩增带;3、无特异性扩增条带可能原因

阳性对照有扩增条带，说明酶、底物、bf无问题，检验模板与引物，普通是引物问题。

可能退火温度过高

没有加酶;片状拖带或涂抹带;假阴性

;3.引物：引物设计、质量、浓度、两条引物浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、轻易弥散常见原因。

对策为：

①选定好引物合成单位。

②引物浓度不但要看OD值，更要重视引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带亮度应大致一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商处理。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保留,预防屡次冻融或长久放冰箱冷藏部分,造成引物降解失效。;假阴性

;假阳性;PCR污染对策;(二)吸样枪:因为操作时不慎将样品或模