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滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

摘要：甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊

酸激酶基因GrMK序列，设计一对基因特异性引物克隆该基因，并进行序列分

析；构建原核表达栽体pGEX-4T-l-GrMK，转入大肠杆菌Rosetta（DE3），重组

蛋白在370C、1.0mmoVLIPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明，

GrMK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员，具有MK蛋白保守结构域：乳糖激酶/高

丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶（GHMPkinase）N端结构域、C端

结构域和ATP结合结构域；GrMK与长春花CrMK亲缘关系最近，原核表达结

果表明，融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明

GrMK基因主要在根中表达.这些结果为GrMK蛋白结构和功能的研究奠定基

础。

关键词：滇龙胆：甲羟戊酸激酶；基因克隆；表达分析

滇龙胆GentianarigescensFrach.ExHemsl.是传统中药龙胆品种之一，是滇产

重要道地药材。滇龙胆也是常用大宗药材，是龙胆泻肝片、小儿清热片和苦胆草

片等200多种中成药的主要成分[1]。近年来，国内外市场对龙胆的需求量在3

000—4000吨左右，并且医疗用龙胆需求量每年递增10%左右，市场缺口很大，

导致野生滇龙胆资源遭到毁灭性的破坏[1]。滇龙胆的主要药效成分为龙胆苦苷，

要从根本上解决滇龙胆的药源问题，必须弄清龙胆苦苷生物合成途径及其调控机

制[2]，为龙胆苦苷的异源生物合成奠定基础。

龙胆苦苷属于裂环烯醚单萜，在植物中单萜一般是通过胞质甲羟戊酸

（MVA）途径和质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成的[3]在长春

花MVA途径中，甲羟戊酸激酶（mevalonatekinase，MK，EC6）能够催

化ATP中γ磷酸基团转移到甲羟戊酸C5羟基上，导致甲羟戊酸5-磷酸和ADP

的生成[4]，该酶活性取决于二价阳离子Mg2+或Mn2+，其适宜pH为7～10，最

适pH为8.9[5]。该酶被认为是萜类生物合成的调控酶[6]。在植物中，甲羟戊酸

激酶受下游代谢物反馈抑制，法尼基焦磷酸（FPP）、异戊烯基焦磷酸（IPP）、

DMAPP（二甲烯丙基焦磷酸）和栊牛儿基焦磷酸（GPP），甚至植基二磷酸

（PDP），均能抑制MK蛋白活性I7|。目前，甲羟戊酸激酶基因MK已从拟南芥

[6]、长春花[8]、丹参[9]、秦艽[10]、三七[11]、杜仲[12]、林烟草[13]等许多植

物中分离。Zhuang等将甲烷八叠球菌基因Mm，MyK在大肠杆菌中表达，纯化

后结晶，并使用X射线衍射技术对晶体结构进行了初步分析[14]。MK基因的表

达具有组织特异性，并被生物和非生物因素诱导。在拟南芥中，AtMK基因主要

在根和花中表达；启动子缺失实验结果表明AtMK基因上游-295至-194区域对

于该基因的高表达至关重要[6]。在杜仲中，EuMK3基因启动子中存在大量的光

诱导元件和植物激素诱导元件，因此其转录活性可能受光和植物激素的调控

[12]。在生物诱导剂（100mg/mL酵母提取物）和非生物诱导剂（30mmol/LAg+）

共同诱导下，丹参SmMK基因在诱导后12h表达量达到最高[15]。在乳酸链球

菌中，共表达MVK和HMG基因能够使倍半菲兰烯（倍半水芹烯）产量加倍

[16]。

目前，为选育高产、优质和高抗的龙胆草，云南省已启动长达7年的龙胆草

航天育种工程[17]。但是，由于龙胆基因组资源极度匮乏[18]导致其分子生物学

研究进展缓慢。前期作者实验室分别对滇龙胆的根和叶进行转录组测序，本研究

基于转录组数据库中GrMK基因序列，通过RT-PCR技术成功地从滇龙胆幼叶

中扩增到GrMK基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析，以

期为滇龙胆主要药效成分的生物合成及其调控机理的解析提供帮助。

1材料与方法

1.1植物材料

滇龙胆采自玉溪师范学院分子生物学实验室的组培苗和盆栽苗，由云南省农

业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆Centianarigesc