间充质干细胞调节巨噬细胞抗结核分枝杆菌免疫能力的作用及机制研究.pdfVIP

摘要

背景和目的：结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）侵

入到机体后，诱发以巨噬细胞为主的机体免疫应答病理形成过程。目前结核病治疗

主要依赖于多种抗结核药物的联合使用，但不规范用药或感染耐药菌株常会导致耐

药，研发一种新的治疗手段来降低耐药结核病患者的死亡率已经成为结核病防控领

域的技术瓶颈。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有免疫调

节能力、组织修复活性和归巢能力的干细胞。已有研究显示MSCs在类风湿性关节

炎和肺部疾病等治疗中具有很好的应用前景，对于耐药性结核病治疗也有一些临床

试验，但MSCs能否提高宿主抗Mtb的免疫应答能力及确切的分子机制尚不清楚。

本研究将以感染Mtb的巨噬细胞为细胞模型利用细胞生物学和生物信息学相关技术

对MSCs调节感染Mtb巨噬细胞的免疫能力及机制进行探讨，为推动MSCs产业转

化和结核病治疗的应用提供理论依据和技术支撑。

方法：

1.采用组织贴壁法分离人脐带来源MSCs，并利用流式细胞仪进行多色实验、

油红O、茜素红和甲苯胺蓝染色等方法，对MSCs的形态学特征、CD73等表面免

疫标志物的表达和三系分化能力进行检测，对原代MSCs细胞的特征进行鉴定；

2.利用IFN-γ、TNF-α和IL-1β三种细胞因子对MSCs进行预处理，采用RT-

qPCR检测MSCs细胞中SOX2等干性基因和IL-6等炎性因子的表达，分析细胞因

子预处理对MSCs干性维持和免疫调节能力的影响；

3.将感染H37Ra结核分枝杆菌的THP1巨噬细胞与IFN-γ等不同预处理的

MSCs以Transwell方式共培养，利用荧光探针DCFH-DA和流式细胞仪检测细胞内

ROS释放量，利用RT-qPCR检测细胞内IL-6炎性因子的表达水平，AnnexinV-PI

染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡，Westernblot检测细胞内GSDMD和NLRP3等

细胞焦亡相关指标，分析MSCs对巨噬细胞抗Mtb免疫应答能力的影响以及IFN-γ

等预处理对该能力的提高作用；

4.将感染H37Ra的THP1巨噬细胞与IFN-γ等不同预处理的MSCs以Transwell

方式共培养，利用转录组测序技术检测巨噬细胞内所有转录本的表达，并通过生物

信息学分析，探讨MSCs自身及IFN-γ预处理的MSCs调节巨噬细胞抗Mtb免疫应

答能力的潜在分子机制，并利用RT-qPCR对差异基因进行验证。

结果：

1.分离的MSCs呈长梭形贴壁生长、细胞表面阳性标志物CD73、CD90和

CD105的阳性率均大于95%，阴性标志物HLA-DR的阳性率小于2%，且具有良好

的成脂、成骨和成软骨分化能力，符合国际细胞治疗协会对于MSCs的最低定义标

准；

2.20ng/mLIFN-γ和40ng/mLTNF-α预处理MSCs24h后，相比于未处理组，

细胞内干性基因和炎性因子表达水平升高，10ng/mLIL-1β预处理MSCs后，虽然

细胞内干性基因表达水平不明显，但炎性因子表达水平升高，提示细胞因子预处理

MSCs可维持细胞的干性，提高免疫应答能力；

3.与无MSCs共培养的对照组相比，MSCs共培养的感染Mtb巨噬细胞内IL-

1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显升高、ROS释放量明显增加、细胞凋亡率增加、

细胞焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD表达水平升高；IL-1β预处理后，

巨噬细胞内ROS释放量和细胞凋亡率增加，NLRP3等细胞焦亡相关分子表达水平

升高；IFN-γ和TNF-α预处理MSCs后，细胞内NLRP3等焦亡相关分子水平明显升

高，细胞凋亡率增加，但ROS释放量不明显，提示MSCs自身可以提高巨噬细胞抗

Mtb免疫应答的能力，细胞因子预处理对MSCs提高巨噬细胞抗Mtb感染的能力有

所改善；

4.MSCs调节THP1巨噬细胞抗Mtb感染能力的转录组分析结果显示，与无

MS