DB22_T2081-2014_鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR方法_吉林省.docxVIP

ICS11.020

B41

DB22

吉林省

地方标准

DB22/T2081—2014

鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR方法

MethodoffluorescencePCRforthedetectionofYersiniapestis

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2081—2014

前

言

本标准依据GB/T1.1-2009、GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本标准主要起草人：王玮琳、刘阳、孙舒、聂丹丹、陈光宇、刘韬、刘金华、罗雁非、郑旭

I

DB22/T2081—2014

鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR法

1范围

本标准规定了鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR法。

本标准适用于鼠疫耶尔森菌的实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的

版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

3警告

为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按

GB19489中的有关规定执行。试样制备及核酸提取过程需在生物安全二级及以上实验室内进行。

FAM:6-羧基-荧光素（一种荧光报告基团）（6-Carboxy-fluorescein）。

TTAMRA（Carboxytetramethylrhodamine）。

TE:缓冲液(Tris-ClEDTA)。

Tm值:核酸融解温度（Meltingtempreture）。

Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(Cyclethreshold)。

实时荧光PCR方法，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，

最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧

光探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针

上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积

累荧光。TAMRA探针（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明），是罗丹明类荧光素衍生物，

TAMRA易于被mercuryarclamps的546nm光谱线所激发，且比荧光素具有更好的光稳定性和敏感性。

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DB22/T2081—2014

6.1所用水应符合GB/T6682中的规定。

6.2除特别说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。

6.3引物及探针

上游引物5-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3，

下游引物5-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3，

探针FAM–TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA

6.410%SDS

在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水

定容至1L，分装备用。

6.520mg/ml蛋白酶K

将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容

到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

6.6CTAB/NaCl溶液

在80mL水中溶解4.1gNaCl，缓慢加入10gCTAB，同时加热并搅拌，如果需要，可加热至65℃使其溶

解，定容终体积至100mL。

量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)25mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL,置于100mL烧杯中。向烧杯中

加入约40mL的去离子水，混合均匀，定容至50mL后，高压灭菌备用。

在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2?2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用

NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

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DB22/T2081—2014

7.9恒温水浴箱。

7.10微量离心管：1.5mL。

8试样制备

8.1取25mg～30mg动物组织，放入1.5mL离心管中,加入500μLTE缓冲液,用匀浆仪研碎。匀浆液

10000r/min,离心2min，弃上清，沉淀备用。

8.2将菌液制备成悬浊液，10000r/min,离心2min，弃