DB22_T1745-2012_弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

B41

DB22

备案号：36036-2013

吉

林

省

地

方

标

准

DB22/T1745—2012

弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法

DetectionmethodofpolymerasechainreactionofToxoplasmagondii

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T1745-2012

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准主要起草人：姚新华、苑淑贤、任科研、曹利利、杨金生、程荣华。

I

DB22/T1745-2012

弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法

1范围

本标准规定了聚合酶链式反应（PCR）检测弓形虫的原理、实验材料、仪器设备、试剂、操作程序、

结果判定及废弃物处理和防止污染的措施。

本标准适用于PCR法检测弓形虫。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法。

3原理

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，

通过变性、退火、延伸周期性的多次循环，使两个引物之间的特异性DNA片段得到体外扩增。出现1080bp

电泳条带为阳性，其它为阴性。

5.3台式低温高速离心机。

1

DB22/T1745-2012

5.4电泳槽。

5.5核酸电泳仪。

5.6紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统。

5.7可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。

5.8恒温水浴锅。

6试剂

6.1本标准所用试剂均为分析纯。

6.2无菌双蒸水符合GB/T6682-1992。

6.3溴化乙锭（EB）溶液10mg/mL：参见附录A.1。

6.4电泳缓冲液50×TAE：参见附录A.2。

6.51.5%琼脂糖凝胶：参见附录A.3。

6.6上样缓冲液：参见附录A.4。

6.710×PCR缓冲液：参见附录A.5。

6.8TaqDNA聚合酶2u/μL。

6.9dNTPs2.5mmol/L。

6.10标准分子量DL2000DNAMarker。

6.11引物与PCR扩增结果：参见附录B1。

取病死动物肝、脾、肺、淋巴结等组织10g，磨碎后加生理盐水10mL～20mL制成乳剂，过滤，将

滤液3000r/min，离心10min，弃去上清液，取沉淀物加生理盐水悬浮后，3000r/min，离心10min，取

沉淀加入等体积虫体消化液（0.1mol/LpH值8.0Tris-HCl，1%SDS，0.1mol/LNaCl，10mol/LEDTA）

和蛋白酶K（20mol/L），混匀后置于液氮5min，65℃水浴5min，重复3次操作后，65℃水浴2h，

备用。

取患病或病死动物的腹水3.0mL，加入等体积虫体消化液（0.1mol/LpH值8.0Tris-HCl，1%SDS，

0.1mol/LNaCl，10mol/LEDTA）和蛋白酶K（20mol/L），混匀后置于液氮5min，65℃水浴5min，

重复3次操作后，65℃水浴2h，备用。

将虫体（RH株）用消化液（0.1mol/LpH值8.0Tris-HCl，1%SDS，0.1mol/LNaCl，10mol/LEDTA）

置于65℃水浴锅内裂解2h，10000r/min离心5mim，吸上清，与等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混匀，

5000r/min离心10min，取上清液，加等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提一次，颠倒混匀多次，常

温作用5min，5000r/min离心10min，吸上清，加2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/LNaAC于-20℃放

置30min，10000r/min离心10min，取沉淀物加入无水乙醇700μL，7000r/min离心5min，弃上清，自

然干燥30min-50min，用20μL双蒸馏水溶解，-20℃保存。

2

DB22/T1745-2012

7.1.4阴性对照处理

用健康猪血清DNA作为标准阴性对照PCR模板。

7.2PCR扩增

备检样品PCR为50μL体系：

10×PCR缓冲液

dNTPs

5.0ml

4.0μL

1.0μL

2.0μL