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全基因组测序技术在结核病中的应用进展

郑婷婷向菲

[关键词]?结核病；全基因组测序；耐药结核病；结核分枝杆菌

[中图分类号]?R52????[文献标识码]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.026

1??MTB与基因组测序

结核分枝杆菌复合体（Mycobacterium?tuberculosis?complex，MTBC）的宏基因组测序包括样本准备（样本去污提纯、培养、提取细菌DNA）、制备文库、读取序列及数据分析等流程[6]。目前，WGS的工作流程尚未标准化，用于MTBC-WGS分析的自动化管道有MTBseq、UVP等，其可快速调用单核苷酸多态性（single?nucleotide?polymorphism，SNP），在短时间内分析大量的MTBC基因组数据。ILLumina?MiSeq及Nanopore?MinION等测序仪可应用于WGS。DNA纳米孔测序更为便携，价格合理，耗时较短，且可读取长度为150kb序列[7]。

2??WGS在TB中的应用

2.1??WGS在TB诊断和耐药性检测中的应用

在既往研究中，TB诊断多依赖于传统细菌学证据。WHO建议用筛查的方法发现TB高危人群，人工智能等新型技术手段已用于改善TB诊断的影像学方法中[8]。诊断技术的更迭与进步更多地发生于分子诊断方面，具有高度特异性和敏感度的核酸扩增试验彻底改变既往的诊断格局。WHO推荐常用的TB诊断方法包括线性探针检测、GeneXpert?MTB/RIF检测技术、环介导等温扩增检测及WGS等[9]。

WGS被认为是具有巨大发展潜力的分子诊断方法，其较常规诊断方法的速度更快。Votintseva等[10]研究推测，应用WGS技术有望于24h内确诊患者是否为TB。一项多中心、前瞻性研究表明，基于WGS技术的实验室诊断成本较常规诊断的费用少7%[11]。但为获取足够数量的细菌，在行WGS前还需对临床标本进行细菌培养，从而限制了其应用。新型靶向基因组测序技术可直接对临床样本进行分析，无需培养检测，缩短中位周转时间[12]。但该过程并未实现标准化，仅限于已知的抗性标志物。

MTB对多数抗生素具有天然抗性。除原发高水平抗生素耐药性外，还有继发新获得突变导致的抗生素耐药机制，包括基因突变、药物外排泵、降解修饰、细胞包膜的非渗透性、靶点的改变和模拟等[13]。一线分子诊断方法GeneXpert?MTB/RIF仅可检测利福平的耐药性、识别DNA突变，识别特定耐药突变的数量有限[14]。

在MTB基因组数据的支持下，WGS可筛选出所有与其表型耐药性相关的决定性突变因素。研究表明，WGS检测抗结核药物的敏感度在80%以上，而表型药物的敏感度则不到80%[15]。Papaventsis等[16]研究显示，WGS对利福平检测的敏感度和特异性相似，略高于异烟肼。Wang等[17]研究指出，WGS在预测一线抗结核药物方面较二线药物具有更高的敏感度和特异性，但WGS可能无法检测出尚未确定和新出现的突变。杨婷婷等[18]的研究构建基于WGS数据分析和共享的耐药和传播监测网络、建立SAM-TB平台，对17种抗结核药物的耐药性进行预测并分析遗传关系，优化人们对于易感及耐药TB患者的管理。Huang等[19]对357株MDR-TB進行WGS，提供迄今为止最全面的18种抗结核药物的药物敏感度测试结果。

2.2??WGS在MTB致病机制研究中的应用

MTB可持续存在于机体内，虽临床症状多不明显，但会使机体不断地产生免疫应答，这称为潜伏性结核感染，是活动性TB孵化的温床。Penn-?Nicholson等[20]目前正在开展可预测潜伏性结核感染进展为活动性TB的生物学标志物的相关研究。越来越多的研究开始致力于通过全基因组转录组学方法揭示MTBC与人宿主间复杂的免疫反应。

基因组学的比较分析有助于增强人们对MTB致病机制的理解。目前，MTBC包含7种与人类关系密切的地理分布不同谱系[21]。通过比较MTBC完整基因组序列与其近亲海洋分枝杆菌发现，MTBC是从祖先的环境分枝杆菌进化而来的，经历广泛的横向基因转移，最终成为人类和某些其他哺乳动物的特殊致病病原体[22]。＞0.5kb的多态性区域被定义为差异区域或“RD”位点，其缺失可能与细菌毒力丧失有关，这是卡介苗基因组毒力衰减的基础[23]。

MTB代谢基因组学研究表明，脂肪酸的分解、赖氨酸和亮氨酸的合成、铁的合成、碳循环等均与菌株体内感染相关，脂质和氨基酸是MTB的营养来源[28]。另有研究证实，MTB主要通过阻断吞噬体成熟、酸化及溶酶体融合、降解蛋白酶体等途径实现宿主体内的持续感染[29]。

2.3??WGS在TB传播和防控中的应用

WGS已成功应用于MTBC分离株的研究中。与传统检测方法相比，