RNA引导的RNA核酸内切酶的设计及构建.pdfVIP

武汉轻工大学硕士专业学位论文

摘要

在过去的几十年里，基因编辑的蓬勃发展给生命科学的研究带来了革

命性的变化。锌指核酸酶（zincfingernucleases，ZFNs）、转录激活因子样

transcriptionactivator-likeeffectornucleasesTALENs

效应物核酸酶（，）和

clusteredregularlyinterspacedshort

常间回文重复序列丛集关联蛋白系统（

palindromicrepeats/CRISPRassociatesystem，CRISPR/Cas系统）等可编程

核酸酶的研究进展极大地推动了基因编辑从概念到临床的发展。基因编辑

工具也经历了从靶向DNA到靶向RNA的发展，其中的典型是以Cas13为代表

的系列蛋白。在人类或者细菌中也存在一些通过与RNA结合而定位到特定

工作位点的蛋白，例如发夹RNA结合蛋白能够识别特定的RNA发夹并结合；

同样，在真核或者原核生物中也存在一些非特异性降解RNA的RNA酶，那

么这些蛋白能否被用于开发新一代RNA编辑工具？本研究根据Cas13和发

夹RNA结合蛋白的功能原理，开发靶向RNA的新型基因编辑工具。

主要研究思路和方法如下：（1）选择Cas13X.1结合区域（miniCas13X.1）、

MS2MS2coatproteinMCPTARRNA

噬菌体衣壳蛋白（，）、以及发夹结合

蛋白（TBP6.7）作为新型工具的结合部位；选择来自细菌体内的RNA酶YbeY

作为新型工具的效应蛋白；miniCas13X.1与YbeY组成融合蛋白；MCP与

YbeYTBP6.7YbeY2

组成融合蛋白；与组成融合蛋白。（）将表达红色荧光

蛋白（RFP）的质粒（pEla-RFP）和表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒

pEla-GFPEscherichiacoliBL213

（）转入，建立两个单荧光报告系统。（）

构建细菌内功能验证质粒，将编码融合蛋白和crRNA的基因分别在两个质粒

上表达，以P启动子驱动发夹RNA结合蛋白和YbeY组成的融合蛋白表达，

Tet

以PJ23119驱动crRNA转录，分别转入E.coliBL21/pEla-RFP感受态和E.coli

BL21/pEla-GFP感受态，建立三质粒体系分别验证其是否具有靶向RFP和

GFP的功能。（4）将表达红色荧光蛋白的质粒转染人胚肾细胞（293T），

5

流式细胞仪检测转染效率，及荧光强度。（）构建细胞内功能验证质粒，

将rfp基因、crRNA序列和编码融合蛋白基因序列在同一质粒上表达，以真

EF1ɑrfpU6crRNA

核启动子驱动表达，以真核启动子驱动转录，以真核启动

CMV293Trfp

子驱动融合蛋白表达，转染分别验证其是否具有靶向切割转录

物的功能。（6）将野生型LwCas13a、PspCas13b、RfxCas13d蛋白在E.coli

中克隆与表达，作为后续实验对照。

主要