DB22_T2692-2017_饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌检测双重微滴数字PCR法_吉林省.docxVIP

ICS65.120

B25

DB22

备案号：56305-2017

吉林省地方标准

DB22/T2692—2017

饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌检

测双重微滴数字PCR法

DeterminationofStaphylococcusaureusandBacilluscereusinfeeds-Duplexdroplet

digitalPCRmethod

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2692—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本标准主要起草人：聂丹丹、王宁宁、王准、曲辉、彭勃、孙晶莹、王玮琳、刘金华、罗雁非。

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DB22/T2692—2017

饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌检测双重微滴数字PCR法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问

题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌检测双重微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器

和设备、样品、试验步骤、试验数据处理及防止污染措施。

本标准适用于饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌检测的双重微滴数字PCR法。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.10-2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据金黄色葡萄球菌的nuc

特异性基因序列和蜡样芽孢杆菌的16s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴

定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，

实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的快速定性检验。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。

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DB22/T2692—2017

4.6裂解液，成分包括：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100

mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L

EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl调至pH8.0。

4.7酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。

4.8氯仿。

4.9异戊醇。

4.10无水乙醇。

4.11

异丙醇。

4.1270%乙醇

4.13金黄色葡萄球菌nuc基因引物和探针

nuc上游引物：5’-GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG-3’

nuc下游引物：5’-TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT-3’

nuc探针：5’-（FAM）-CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC-（BHQ1）-3’

4.14

蜡样芽胞杆菌16s基因引物和探针

16s上游引物：5’-CCTTATGACCTGGGCTACAC-3’

16s下游引物：5’-AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC-3’

16s探针：5’-（HEX）-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-（ECLIPSE）-3’

5

仪器和设备

5.1微滴生成仪。

5.2PCR仪。

5.7微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～

200μL，100μL～1000μL。

5.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

5.9恒温水浴箱。

按照GB/T14699.1对饲料进行采样（5.6），金黄色葡萄球菌样品的增菌培养（5.9）按照GB/T14699.1

进行，蜡样芽胞杆菌的样品增菌培养按照GB/T26427进行。

7试验步骤

按照6中培养的金黄色葡萄球菌增菌液各取1mL（5.7），同时在MYP培养基选取一个疑似菌落到

盛有1mL无菌生理盐水的1.5mL无菌离心管中，12