食品病源菌检测芯片.ppt

食品病源菌试剂套组在同一片芯片上侦测并且鉴定食品中9种细菌金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌、仙人掌杆菌、肉毒杆菌、耶尔辛氏菌、弧菌、志贺氏菌、单核细胞增多性利斯特菌

食品病源菌试剂套组目的-同时侦测并且鉴定食品中9种细菌，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌、仙人掌杆菌、肉毒杆菌、耶尔辛氏菌、弧菌、志贺氏菌、单核细胞增多性利斯特菌.操作程序-食物样品采集?培养?DNA纯化?DNA放大?杂交反应?呈色反应应用-侦测食品中细菌，减少消费者食物中毒机率.提供食品业者有效的食品加工制程管理.

操作程序食物样品采集样品的采集与制备方法依食品的类别而异,详情可参考USFDABAMChapter1“FoodSamplingandPreparationofSampleHomogenate”培养取1mL或1g已均质化的食品样品,加入10mLLBbroth,在37oC下培养过夜.

操作程序DNA纯化取1mL培养液在6,000g下离心5分钟,移除上清液.加1mLE1溶液,震荡至完全混何均匀,在8,000g/4℃下离心5分钟,移除上清液.加50mLE2溶液,震荡至完全混何均匀,并在沸水中加热10分钟.置于冰上冷却1-2分钟,在8,000g下离心5分钟.收集含有DNA的上清液进行放大步骤.*若不马上使用DNA萃取液,必须将它存放于–20℃,并且在2日内使用.

操作程序DNA放大依右表制备PCRMasterMix.溶液每个反应所需体积FM46.5mLDNAPol.0.5mL每个样品使用3mL已纯化的DNA;PCR阴性控制组以3mL无菌水取代;PCR阳性控制组以3mLPC(阳性控制组模板).每管的最终体积为50mL.加DNA模板

操作程序DNA放大将所有PCR管放在PCR机器,并依以下程序进行DNA放大.PCR放大后的PCR产物可以直接进行杂交反应.*若不马上使用,请保存在-20oC.

操作程序杂交反应每个反应取500μLofDR.Hyb溶液.将DR.Hyb溶液及清洗液回复至室温.将杂交箱预热至50oC.7制备

操作程序杂交反应Hybridization7取50μLPCR产物与500μLDR.溶液,并且完全均匀混合.将混合液置于沸水中5分钟进行变性.?变性后,立即将试管放入冰中冷却.将混合液全部置入杂交盒,并盖上盒盖.于50oC反应1小时.打开盒盖，倒掉杂交液，以500μL杂交洗涤液清洗3次.杂交反应

操作程序讯号检出与呈色(1)取500μL类二次抗体稀释剂(BlockingReagent)与0.5μL类二次抗体(Strep-AP)充分混合后，加入杂交盒中，室温反应30分钟.倒掉杂交盒中之反应溶液，以500μL杂交洗涤液冲洗3次.以500μL呈色原稀释剂(DetectionBuffer)清洗芯片后倒出.

操作程序讯号检出与呈色(2)取490μL呈色原稀释剂与10μL呈色原剂(NBT/BCIP)混合均匀后，加入杂交盒中，避光反应10分钟.以蒸馏水清洗芯片并干燥(勿碰触芯片表面)后即可以DR.AiM判读机判读结果.

设计原理及探针位置食品病源菌试剂套组●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●杂交阳性控制点●金黄色葡萄球菌●沙门氏杆菌属●大肠杆菌-志贺式菌属●单核细胞增多性利斯特菌●仙人掌杆菌●耶尔辛氏菌●肠炎弧菌属●肉毒杆菌●PCR阳性控制点●阴性控制点

结果结果判读金黄色葡萄球菌沙门氏杆菌属大肠杆菌–志贺式菌属单核细胞增多性利斯特菌●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●