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胶原蛋白酶gene克隆表达检测实验

2.1.2培养基

LB培养基：蛋白胨1%；酵母粉0.5％；NaCl1%；pH7.0-7.2；固体培养基加

琼脂1.6%。

ICPM培养基：蛋白胨0.6%，葡萄糖0.5%，CaC0.1%，MgS0.05%，KHP

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0.05%，pH7.0。

明胶培养基：明胶4%，蛋白胨0.4%，酵母粉0.1%，NaCI0.4%，琼脂1.5%；

pH7.0。

选择培养基：在上述相应培养基中加入抗生素，用于转化子筛选或重组菌株

培养。各抗生素除指明外，其终浓度为：氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：100μg/mL；

红霉素(Erythromycin，Erm)：25μg/mL；卡那霉素(Kanamycin，Kan)：50μg/mL。

大肠杆菌菌株在37°C培养，苏云金芽胞杆菌菌株在28°C培养。

2.1.3试剂

2.1.3.1质粒抽提所用试剂

STE：0.1mol/LNaCI，10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)；

溶液I：1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5mol/LEDTA(pH8.0)，50mmol/L葡萄

糖。115℃灭菌15min，4°C保存；

溶液II：1%SDS，0.2mol/LNaOH；

溶液III：3mol/LKAc，11.5%冰乙酸(V/V)；

苯酚/氯仿/异戊醇：体积比为25:24:1，混合4°C保存；

溶菌酶：称取100mg溶于1mL溶液I中；

RNase液：称取0.01g溶于0.9mL0.03mol/LNaAc然后煮沸15min，最后

加入0.1mL1mol/LTris-HCl(pH7.6)，配制成母液浓度为10mg/mL，苏云金芽胞

杆菌质粒使用浓度为20μg/mL，大肠杆菌质粒使用浓度为1μg/mL。

2.1.3.2感受态制备所用试剂

SGbuffer：272mmol/L蔗糖，15%甘油；

EPbuffer：SGbuffer含0.5mmol/LMgCl和0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)；

2

灭菌：SGbuffer，MgCl，磷酸钾缓冲液分别配制灭菌，SGbuffer115°C20

2

min，磷酸钾缓冲液和MgCl121°C30min。

2

2.1.3.3SDS凝胶电泳所用试剂

30%聚丙烯酰胺母液配制：将29g丙烯酰胺和1gN,N-亚甲双丙烯酰胺溶于

60mLddH中，搅拌溶解，定容至100mL，过滤后4℃避光保存；

2

SDS凝胶电泳缓冲液配制：0.192mol/L甘氨酸，25mmol/L

Tris-HCl(pH8.3)，0.1%SDS；

2×SDS凝胶电泳上样缓冲液配制：100mmol/LTris-HCl(pH6.8)，20%

甘油，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，4%SDS，0.2%溴酚蓝；

染色液配制：25mL异丙醇，10mL冰乙酸，0.1g考马斯亮蓝，定容到100

mL；

脱色液配制：62.5mL乙醇，25mL冰乙酸，定容到250mL。

2.1.3.4供试昆虫及生物测定饲料

棉铃虫(Helicoverpaarmigera)从湖北省农科院Bt中心和中科院武汉病毒所

实验动物中心购买；

()；

磷酸缓冲液：0.1mol/LKHP和0.1mol/LKHP混合pH7.0