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GB/T14926.26—202X

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附录A

（规范性附录）

小鼠脑脊髓炎病毒核酸检测方法

A.1采样及样本的处理

采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套

A.1.1脏器组织

活体动物采用安乐死方法进行处死，剖检，无菌采集动物的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和肠，待检

样品按照5倍比例加入灭菌PBS，组织匀浆器充分匀浆3~5分钟，离心取上清液转入另一无菌离心管中，

编号备用。

A.1.2盲肠内容物或粪便

无菌采集动物盲肠内容物或粪便，按照5倍比例加入灭菌PBS，充分匀浆，离心取上清液转入另一

无菌离心管中，编号备用。

A.1.3细胞培养物

将接种后出现CPE或可疑的细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于15mL离心管中，12000r/

min离心10min，去细胞碎片，上清液转移到无菌15mL离心管中，编号备用。

A.1.4实验动物环境样本

A.1.4.1实验动物饲料、垫料和饮水

取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中，加入10倍体积灭菌PBS（饲料和垫料需全部浸泡

于液体中）。密封后浸泡5~10min，充分混匀，将混悬液转移至15mL离心管中，4℃，12,000rpm离心

10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。取适量实验动物饮水直接转移到无菌5mL

离心管中，编号备用。

A.1.4.2实验动物设施设备

用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15mL离心管，

加入适量灭菌PBS，浸泡5~10min，充分混匀，取出棉拭子，将离心管于4℃，12,000rpm离心10min，

取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。

A.1.5样本的存放

采集或处理的样本在2~8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置-80℃冰箱，但应避免

反复冻融（冻融不超过3次）。

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A.2病毒核酸提取

选择市售商品化RNA提取试剂盒。按照试剂盒操作说明书提取样品中的RNA。在提取RNA时应

设立阳性和阴性对照样品，按同样方法提取RNA。RNA的提取操作应在生物安全柜中进行，避免RNA

气溶胶的污染。制备好的RNA应尽快进行下一步PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，应于-80℃冰

箱保存备用。

A.3实时荧光RT-PCR

A.3.1反应体系

一步法实时荧光RT-PCR反应体系见表2。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、

阴性对照和空白对照，其中阳性对照以含有TMEV的组织或细胞培养物提取的RNA作为阳性对照模板，

其中阴性对照以不含有TMEVRNA样本（可以是正常动物组织或正常细胞培养物）作为阴性对照模板，

空白对照即为不加模版对照（NoTemplateControl，NTC），即在反应中用水来代替模板。

表2每个样本反应体系配制表

反应组份用量/μL终浓度

2×OneStepRT-PCRBufferIII251×

ExTaqHS(5U/μL)1

PrimeScriptRTEnzymeMixII1

ForwardPrimer(10μM)1200nM

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