临床免疫学检验课件 第10章 生物素-亲合素放大技术学习资料.pptVIP

第十章生物素-亲合素放大技术第一节生物素(B)理化性质与标记一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)生物素活化活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标记氨基标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素标记核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针二、生物素标记蛋白质活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性；对BNHS多标记抗体,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低；选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度0.5~5μg/ml;生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。二、亲合素/链霉亲合素标记标记物：酶、胶体金异硫氰酸荧光素（FITC）HRP-AV(SA)过碘酸钠、戊二醛ABC/SABC预制AV(SAV)-Biotin第三节生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度一个亲和素能结合4个分子的生物素二、特异性亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性三、稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍四、适用性生物素和亲和素均可制成多种衍生物，可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合五、其他生物素化第二抗体等一个亲和素能结合4个分子的生物素BAB-ELISA夹心法第四节生物素-亲合素系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。一、生物素-亲合素系统基本类型及原理BAB法：Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特点：以游离A分别连接B-Ab和B-EBA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A-B·E特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省却了加B-E的步骤3.

ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用BAS在ELISA中的应用生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测小结生物素—亲合素（链霉亲合素）系统具有的多级放大独特效应，可极大地提高分析测定的灵敏度；二者之间的高亲和、