高效液相色谱-串联质谱法测定人血清中5种抗真菌药物及相关代谢产物的测量方法.docxVIP

背景介绍

近年来随着医学技术的不断发展，器官移植、骨髓移植、重症感染的患者逐年增多，发生侵袭性真菌感染和抗菌药物的耐药率迅速上升，唑类抗真菌药物成为临床应用最广泛的抗菌药物之一。但一些抗真菌药物在个体内和个体间存在较大的个体变异，在治疗过程中患者体内的药物浓度可能会“因人而异”，因此对其进行血药浓度监测具有临床意义。本文阐述了一种能够同时检测多种抗真菌药物的方法，能够帮助临床准确定量患者体内的抗真菌药物浓度，避免出现用药不足或用药过量而导致的副反应。

文章亮点

01.建立了一种LC-MS/MS法检测人血清中5种抗真菌药物及2种代谢产物的血药浓度的方法；

02.对该方法进行了性能验证，该方法准确度好，精密度高，基质效应小；

03.研究了一种能够使多种抗真菌药物稳定的基质配方，病毒和微生物感染风险小，为实现临床检测提供基础。

内容介绍

1实验部分

1.1?主要仪器与试剂

1.2??样品前处理

1.3??分析方法

1.4?溶液的配制

标准储备液的配制：准确称取适量VRC、VNO、PCZ、ICZ、HICZ、FCZ、CPF标准品，用甲醇分别溶解并配制成浓度为1mg/mL的标准储备液。分别移取不同体积的储备液于同一容量瓶中，配制成混合标准溶液。储备液于-80℃冰箱中保存，混合标准溶液于-20℃冰箱中保存。

1.5??定量方法

采用空白基质加标做曲线，同位素内标法定量，样本与基质匹配标准品、质控物样本一同处理后进样，用仪器自带软件绘制标准曲线并定量。

2结果与讨论

2.1??样品前处理方法的建立

通过对血液样本进行蛋白沉淀后，并对上清液进行稀释。稀释后能够减少样品中杂质成分进入检测器对分析物产生干扰，同时减少基质效应的产生，但稀释液的种类影响目标分析物的稳定性。

2.2??液相方法的建立

为了改善分离度和峰形，本方法通过改变流动相的pH来改善。采用5mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸的水溶液为流动相A，0.1%的甲酸乙腈溶液为流动相B，添加乙酸铵是为了增加响应较低的伊曲康唑和羟基伊曲康唑的灵敏度；选择添加甲酸，是为了改善卡泊芬净的色谱峰形，在A相和B相中同时添加同浓度的甲酸，是为了保证在A相和B相任意比例混合时，始终保证体系在相同的酸碱度下进行分离，色谱分析更稳定。图2中a为流动相中未加酸的卡泊芬净的色谱峰，b为流动相中添加甲酸后的卡泊芬净的色谱峰，由图可知，添加甲酸可改善卡泊芬净的峰形。

2.3??基质匹配标准品和质控物基质的考察

由于基质的添加，标准品和质控物的稳定性存在一定问题，图4为不加任何稳定剂的两种浓度的标准品加速结果，伏立康唑氮氧化物、伊曲康唑等响应降低。

2.4??相对基质效应考察

基质效应是指基质成分和目标化合物在进行离子化时，因相互竞争而导致目标化合物信号强度有不同程度增强或减弱的现象。标准曲线和分析物的基质不同时，应该进行基质效应评估。因此，评估基质效应是LC-MS方法验证的关键组成部分[18]。采用混合实验的方法，对本方法的相对基质效应进行评估。

2.5??线性考察

通过向空白人血清中添加一定浓度的混合标准溶液制成低值样本S1和高值样本S7，将S1和S7按不同比例混合配制成线性样本S2~S6。每个浓度点按照1.2方法重复测定3次，分别得出每个浓度点测定结果的均值，以稀释浓度为自变量，以测定结果均值为因变量求出多项式回归方程，计算相关系数R2。

2.6??准确度考察

通过向已知浓度人血清样本中添加混合标准溶液，测定加标回收率，来评估方法的准确度。

2.7??精密度考察

通过向空白人血清样本中添加混合标准溶液，配制成低、中、高3个浓度的精密度样本，每个浓度制备5个平行样，按照1.2方法测定，考察批内精密度，上述样本重复制作并测定3d，考察批间精密度。结果表明，本方法有良好的精密度。

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结论

本文建立了一种能够同时检测人血清中5种抗真菌药物及其代谢产物的HPLC-MS/MS方法，方法简便，以同位素为内标，准确度高，基质匹配标准品和质控物稳定，能够用于临床对伏立康唑、伏立康唑氮氧化物、泊沙康唑、伊曲康唑、羟基伊曲康唑、氟康唑、卡泊芬净的药物浓度监测,以及时调整患者的药物剂量及避免副反应的发生。