分子生物学 分子生物学研究方法（上）课件.ppt

分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite脉冲电场凝胶电泳效果分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖准备转化态细胞42℃热冲击电转化加入外源DNA细胞复苏平板筛选CaCl210%甘油蓝白斑筛选+抗生素+IPTG+X-gal要灵活运用，根据不同情况设计筛选策略！分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite电转化仪分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点，科学家又发明了DNA分子的体外包装法分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite延伸：其他基因导入方法分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite蓝白斑筛选分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.2.3聚合酶链反应技术模板引物DNA聚合酶dNTPMg2+PolymeraseChainReaction，PCR分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite变性退火延伸分子生物学_许晓东_5-NXPowerLitePCR引物设计：①引物的长度一般为15-30bp。

②引物在模板内最好具有单一性，特别是3’端。

③引物序列的GC含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大。

④避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构。引物二聚体引物不专一分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite聚合酶（Taq酶）Taq酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使3‘端凸出一个A，可用于TACloning.分子生物学_许晓东_5-NXPowerLiteRT-PCR(反转录PCR)分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.2.4实时定量PCR分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite分子生物学_许晓东_5-NXPowerLiteTaqMan荧光探针SYBRGreen荧光染料分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.2.5基因组DNA文库的构建从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库。分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite用λ噬菌体建立DNA文库示意图其他载体：bacterialartificialchromosome(BAC)p1artificialchromosome(PAC)yeastartificialchromosome(PAC)分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.3RNA基本操作技术总RNA的提取mRNA的纯化cDNA的合成cDNA文库的构建基因文库的筛选分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.3.1总RNA的提取RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。异硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.3.2mRNA的纯化分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.3.3cDNA的合成cDNA(complementaryDNA)分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite分子生物学_许晓东_5-NXPowerLite5.3.4cDNA文库的构建cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。步骤：在获得高质量的mRNA