DB50_T1254-2022_山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光定量PCR检测方法_重庆市.docxVIP

ICS

11.220

CCSB41

DB50

重庆市地方标准

DB50/T1254—2022

山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光

定量PCR检测方法

重庆市市场监督管理局

发布

DB50/T1254—2022

前??言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由重庆市农业农村委员会提出并归口。

本文件起草单位：重庆市畜牧科学院、西南大学、重庆市酉阳土家族苗族自治县畜牧产业发展中心。

本文件主要起草人：陈静、叶超、方仁东、何玮、徐远东、范彦、黄德均、赵金红、孙晓燕、黎年

富。

I

DB50/T1254—2022

山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光

定量PCR检测方法

1范围

本文件规定了山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光定量PCR检测方法的缩略语、原理、试剂和

耗材、仪器和设备、样品采集、运输与保存、操作步骤、结果判定、实验室生物安全要求等内容。

本文件适用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒核酸的检测。

2

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489

实验室生物安全通用要求

GB/T22915口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法

NY/T541

兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

ENTV-2山羊地方性鼻内肿瘤病毒（Enzooticnasaltumorvirus2ofgoats）

gDNA基因组DNA（genomicDNA）

RNA核糖核酸（RibonucleicAcid）

1

DB50/T1254—2022

根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因特定的序列设计合成一对特异性引物，该对引物能针对ENTV-2

目的基因进行扩增，产生双链DNA片段，在qPCR反应体系中加入的EvaGreen荧光染料能与双链DNA

片段结合而产生荧光信号，通过检测PCR反应液中的荧光信号强弱，实现对目的基因的准确定量。随

着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

6试剂和耗材

6.1除特别说明外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水

处理后高压灭菌）分装。

6.2

RNA提取试剂：Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、DEPC水，或其他同等效果的商品化试

剂盒。

6.3

反转录试剂：5×gDNABuffer（含gDNase）、FQ-RTPrimerMix、FastKingRTEnzymeMix、10×King

RTBuffer；或其他同等效果的商品化试剂盒。

6.4反应液：EvaGreen荧光定量PCR反应液。

6.5特异性引物：ENTV-2-F：GAGGCAAATTGAGGCGTTGAT；ENTV-2-R：CCCGTTCTGCATTCG-

CTGTAG（靶序列见附录A）。

6.6阴性对照：DEPC水。

6.7阳性对照：质粒pMD-19T-ENTV-2。

6.8

PBS溶液：按照GB/T22915中PBS溶液配制的规定执行。

1.5mL离心管（无RNA酶）。

6.9

6.10

0.2mLPCR管。

7.6微量可调移液器（2.5μL，10μL，100μL，1mL）及配套带滤芯吸头。

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行。山羊鼻腔内有鼻液的直接用医用棉签采集，无鼻液

的用蘸有PBS溶液的医用棉签采集，拭子放入1.5mL离心管内，做好标识，再将离心管放入塑料自封

2

DB50/T1254—2022

8.2保存

按照GB/T22915的规定执行。采集或处理好的样品在0℃～4℃条件下保存不应超过24h；如

需长期保存，应置-80℃冰箱，避免反复冻融。

9操作步骤

9.1样品处理

在生物安全柜中，向装有拭子的1.5mL离心管中加入灭菌PBS溶液0.5mL，在涡旋振荡器上振

荡15s，吸出全部PBS悬液备用。

9.2病毒RNA的提取

9.2.1吸取上述样品处理后的PBS悬液0.2mL置入新的1.5mL离心管，加入0.7mLTrizol，涡旋振

荡15s，室温静置10min。

9.2.2加入0.2mL三氯甲烷，涡旋振荡15s，4℃12,000rpm离心10min，取