放射性示踪的标记技术.ppt

第三节

蛋白质和多肽的放射性碘标记原理:大多数有机化合物分子中并没有碘原子，但由于碘原子具有高度的化学活性，所以放射性碘很容易通过置换法取代肽链上酪氨酸苯环的氢原子而得到碘标记的化合物。碘标记率与被标记的蛋白质、多肽类激素分子中酪氨酸的含量及暴露程度有关。放射性碘有131I、125I、123I、124I等，其中125I和131I是生物医学中最常用的放射性核素。第30页，共54页，星期日，2025年，2月5日碘标记化合物的优点放射性比活度高，可提高分析的灵敏度；它们的半衰期不短也不长，很适于生物样品的测量；特别是125I能放出均匀的γ射线，便于体外进行γ计数测量，易于推广。放射免疫测定法多半使用碘标记的化合物，可用碘-125放免仪进行测量。123I和124I标记化合物主要用于核医学临床功能检查，131I用于甲状腺疾病和各种肿瘤的治疗，125I标记化合物则主要用于生物医学研究与体外示踪分析。第31页，共54页，星期日，2025年，2月5日放射性碘的标记方法1.氯胺-T（Ch-T）法氯胺-T是一种较温和的氧化剂，在水溶液中形成次氯酸，能连续不断地将溶液中的碘离子I-氧化为分子态的碘*I2或*I+，在pH为7.5的环境里能与蛋白质的酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子发生置换反应，制得碘标记物。第32页，共54页，星期日，2025年，2月5日放射性碘的标记方法2.乳过氧化物酶法用乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）催化过氧化氢（H2O2）释放出活泼的新生态氧，使125I离子活化并标记在蛋白质酪氨酸残基上的一种标记方法。以标记蛋白质为例，LPO与H2O2首先形成络合物，将放射性碘负离子氧化成碘分子，在LPO的催化下，将蛋白质碘化。此类酶催化反应速度很快，标记物比活度高，又保持其生物活性和免疫活性。特别适用于一些容易失活的多肽类的标记，如血纤维蛋白原、胰岛素、嘧啶、核苷和组氨酸等小分子化合物。第33页，共54页，星期日，2025年，2月5日放射性碘的标记方法3.固相氧化剂法包括Iodogen标记法和IodoBeads标记法两种。Iodogen（1，3，4，6-tetrachloro-3α-6α-diphenlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂。Iodogen在碘标记过程中起催化作用，使用时毋须新鲜配制，催化反应终止时不需加还原剂。Iodogen和Ch-T同属于氯酰胺碘化反应类型，是一种不溶于水的固相氧化剂，能将放射性碘负离子氧化成碘分子，从而与蛋白质或多肽分子中酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子发生置换反应。该法已用于单克隆抗体、多肽、生物膜和活细胞的碘标记。第34页，共54页，星期日，2025年，2月5日放射性碘的标记方法3.固相氧化剂法Iodogen标记法不与蛋白质密切接触，反应过程中的氧化损伤小，反应时间易控制，碘利用率高于Ch-T法，利用Iodogen不溶于水的特点，可直接对培养细胞进行碘标记，方法简便。第35页，共54页，星期日，2025年，2月5日放射性碘的标记方法4.联接标记法（conjugationallabeling）这是一种间接标记方法。先使放射性碘与联接剂相结合，然后碘标记的联接剂再结合到蛋白质或多肽分子上，成为标记化合物。最常用的联接剂是3-（对-羟基苯）丙酸-N琥珀亚胺酯酰化剂（HPNS，即Bolton－Hunter试剂）。基本原理是：在Ch-T作用下，先用Na125I使酰化剂HPNS碘化。然后在弱碱性条件下，125I-HPNS通过一个酰氨键与蛋白质N末端的氨基联结，制得蛋白质标记物。此法适用于缺乏酪氨酸的蛋白质如卵清蛋白、肌红蛋白的标记。第36页，共54页，星期日，2025年，2月5日第四节

核苷和核苷酸的放射性标记一、32P-核苷酸标记技术磷和硫是核酸和蛋白质本身所含有的元素。32P标记的核苷酸类是基因工程研究中不可缺少的标记化合物，如用于DNA序列测定；35S-胱氨酸和35S-蛋氨酸用于研究蛋白质代谢过程，它们均为生物医学中不可缺少的试剂。32P及35S均发射β-射线，32P（T1/2=14.3d，Emax=1.71MeV）和35S(T1/2=87d，Emax=0.167MeV)标记物的制备主要有化学合成、生物合成、酶促法和同位素交换法等。两种核素比较，35S能量低，不需特殊防护，电泳自显影条带清晰，分辨率高。而32P则因射线能量较高，实验中应加必要的防护第37页，共54页，星期日，2025年，2月5日一、32P-核苷酸标记技术γ-32P-ATP（32P-三磷酸腺苷）和α-32P-d