基因工程载体.pptVIP

（一）酵母人工染色体（YAC）把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。装载量为350-400kb含有的元件：酵母自主复制序列(ARS)着丝粒序列(cen)四膜虫端粒（tel）质粒选择标记酵母系统的选择标记质粒复制起点第24页，共40页，星期日，2025年，2月5日一、YAC的基本序列元件酵母染色体DNA自主复制序列（ARS）酵母染色体的着丝粒序列（CEN）酵母染色体的端粒序列（TEL）酵母人工染色体（YAC）YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。第25页，共40页，星期日，2025年，2月5日酵母自主复制序列（ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必需的信号。第26页，共40页，星期日，2025年，2月5日酵母着丝点(CEN)在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。pYAC4：酵母第四条染色体的着丝粒。第27页，共40页，星期日，2025年，2月5日正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel）定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构。第28页，共40页，星期日，2025年，2月5日二、?YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型

URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型

LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型SUP4：赭石突变抑制基因第29页，共40页，星期日，2025年，2月5日克隆位点：位于sup4基因内SuP4是一个赭石突变（UAA）抑制基因。宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2。在赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，sup4基因抑制赭石突变，则形成正常白色菌落；有外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则形成红色菌落，十分容易挑选出有DNA插入片段的红色菌落，建成YAC文库。第30页，共40页，星期日，2025年，2月5日YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体。三、克隆策略第31页，共40页，星期日，2025年，2月5日酵母人工染色体的使用第32页，共40页，星期日，2025年，2月5日四、酵母人工染色体（YAC）缺点首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失和基因重排的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。第三，YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，就很难从中分离出来，影响了YAC载体的广泛应用。第33页，共40页，星期日，2025年，2月5日（二）细菌人工染色体（BAC）1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于100kb的DNA。用于：克隆大型基因簇结构构建动植物基因文库第34页，共40页，星期日，2025年，2月5日

F因子的特点

又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞1～2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC中外源基因的重组和嵌合度第35页，共40页，星期日，2025年，2月5日新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒：F因子的parA，parB，parC基因以保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞oriS基因：来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子第36页，共40页，星期日，2025年，2月5日BAC优点：BAC载体容载能力一般为100-350kb?,虽然容量没YAC?大，但BAC?具更多优点：1)以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC?文库比YAC?文库更容易；2)BAC?载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取质粒较方便,而从酵母中分离DNA?较难；3)BAC?复制子源于F?因子,可稳定遗传,嵌合及重组现象少；4)?可通过菌落原位杂交筛选目的基