新解读《GB_T 43450 - 2023化学品 急性眼刺激体外细胞试验 TRPV1活性检测法》最新解读.pptxVIP

《GB/T43450-2023化学品急性眼刺激体外细胞试验

TRPV1活性检测法》最新解读

一、TRPV1活性检测法的核心原理深度剖析

（一）TRPV1通道的神秘面纱

TRPV1作为一种非选择性阳离子通道，在人体生理活动中扮演着关键角色。它广泛分布于眼部组织，如角膜、

结膜等。其特殊的结构赋予了它对化学刺激高度敏感的特性。当外界刺激到来时，TRPV1通道如同精密的传感器，迅速做出响应。在眼部，这种响应与眼刺激性密切相关。例如，当眼部接触到刺激性化学品时，TRPV1通道的构象会发生改变，从而开启离子运输的大门。其对钙离子具有高渗透性，一旦通道打开，钙离子便会迅速内流。在角膜上皮细胞中，TRPV1通道的激活能引发一;

系列细胞内信号传导，这是眼刺激性反应的初始分子事

件，为后续炎症反应的发生奠定了基础。

（二）钙离子内流引发的细胞连锁反应

钙离子作为细胞内重要的第二信使，其浓度的瞬间升高会触发一系列复杂的细胞反应。当化学品激活TRPV1通道导致钙离子内流后，细胞内的钙信号通路被激活。在细胞内，钙离子可以与多种钙结合蛋白相互作用。其中，钙调蛋白（CaM）是一种重要的钙结合蛋白，它与钙离子结合后，能够调节多种酶的活性。例如，激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK），CaMK可以进一步磷酸化下游的靶蛋白，从而调节细胞的代谢、基因表达等过程。在眼刺激性反应中，这些细胞反应最终导致炎症介质的释放，如前列腺素、组胺等。这些炎症介质会;

引起眼部血管扩张、组织水肿等，进而产生眼刺激症状。

通过检测细胞内钙离子浓度的变化，我们便能洞察

TRPV1通道的活性状态，从而评估化学品的眼刺激性。

二、适用范围的精准界定与意义

（一）适用化学品的特性要求

该标准明确规定适用于溶于水且受试溶液pH值在6.5-7.8范围内的化学品。这一规定是基于多方面的考量。

从化学角度来看，水溶性化学品在进入眼部后，更容易与眼部组织中的细胞发生相互作用。而非水溶性化学品可能难以均匀地分布在眼部组织中，影响试验结果的准确性。对于pH值的限制，是因为眼部组织的生理环境接近中性。当受试溶液pH值偏离这个范围过大时，可能会直接对眼部细胞造成损伤，干扰对化学品本身眼刺;

激性的判断。例如，强酸性或强碱性溶液即使本身不具

有特定的眼刺激性化学品成分，也可能因pH值问题导致眼部细胞的酸碱灼伤，使试验结果出现偏差。

（二）为何设定如此严格的范围

严格设定适用范围对于确保试验的科学性和准确性至关重要。在研发化妆品、洗涤剂等日常化学品时，许多成分都是水溶性的，且生产过程中会将产品的pH值控制在接近生理的范围。通过对这类化学品进行TRPV1活性检测，可以更真实地模拟它们在实际使用中对眼睛可能产生的刺激。如果不设定这样的范围，将各种特性的化学品都纳入检测，会使试验结果变得复杂且难以分析。一些特殊化学品的物理化学性质可能会干扰TRPV1通道活性检测的准确性，导致误判。设定明确的适用范围;

能让检测结果更具针对性和可靠性，为化学品的安全评

估提供坚实的基础。

三、仪器与试剂耗材的关键作用及选择要点

（一）核心仪器的功能与必备性能

1.二氧化碳培养箱：它为TRPV1-HEK293细胞的生长提供了适宜的环境。温度需精确控制在37℃±1℃,

这是人体细胞生长的最适温度，微小的温度偏差都可能影响细胞的代谢和生长速率。二氧化碳体积分数为5%±1%，其作用是维持培养液的pH值稳定。细胞在生长过程中会产生代谢产物，影响培养液的酸碱度，二氧化碳通过与培养液中的碳酸盐缓冲体系相互作用，确保pH

值始终处于细胞适宜生长的范围。相对湿度为90%±

5%，可以防止培养液过度蒸发，维持细胞生长环境的稳;

定性。例如，若培养箱的温度过高，可能导致细胞内蛋

白质变性，影响细胞的正常功能；若二氧化碳浓度不足，培养液pH值会升高，同样不利于细胞生长。

2.高通量实时荧光检测分析仪：在试验中，它用于实时监测细胞内钙离子浓度的变化。其工作原理是基于荧光共振能量转移（FRET）技术。当细胞内钙离子与特定的荧光染料结合后，荧光信号会发生变化。该仪器能够快速、准确地检测这种变化，并将其转化为可分析的数据。它具有高灵敏度和高分辨率的特点，能够捕捉到细胞内钙离子浓度的微小波动。在检测低浓度化学品对TRPV1通道活性的影响时，其高灵敏度的优势便能充分体现，确保不会遗漏任何潜在的眼刺激性信号。

（二）试剂耗材的特性与重要性;

1.DMEM培养基：它是细胞培养