核酸的分离纯化.pptVIP

（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。第30页，共48页，星期日，2025年，2月5日常用方法：1加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日3酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日（三）核酸的沉淀沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日关于核酸的分离纯化第1页，共48页，星期日，2025年，2月5日分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术第2页，共48页，星期日，2025年，2月5日基因工程诞生的基础1、理论上的三大成就2、技术上的二大发明第3页，共48页，星期日，2025年，2月5日三大成就：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；1928FrederickGriffith1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验第4页，共48页，星期日，2025年，2月5日2.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一张能反映DNA美丽双螺旋结构的X射线照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-FranklinWilkins第5页，共48页，星期日，2025年，2月5日Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrickJamesWatson三位科学家因为对这一成果的贡献，共享1962年的诺贝尔生物学奖第6页，共48页，星期日，2025年，2月5日ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselsonFranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway第7页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod第8页，共48页，星期日，2025年，2月5日但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。第9页，共48页，星期日，2025年，2月5日两大技术保证：1.DNA的体外切割和连接1962