DB23T-野生越橘根际细菌、真菌资源调查技术规程.docVIP

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黑龙江省市场监督管理局发布××××-××-

黑龙江省市场监督管理局发布

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野生越橘根际细菌、真菌资源调查技术规程

（征求意见稿）

起草单位：黑龙江省林业科学研究所

联系人：李丽丽

联系电话电子邮箱：lilili0622@126.com

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DB23

黑龙江省地方标准

ICS65.020.01

CCSB05

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省林业和草原局提出。

本文件起草单位：黑龙江省林业科学研究所。

本文件主要起草人：李丽丽，杨洪一，李向东，孙国芝，汪春蕾，葛文志，王福德，崔崧，李佳一，郜宪宇。

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野生越橘根际细菌、真菌资源调查技术规程

1范围

本文件规定了野生越橘根际真菌、细菌资源调查的对象及要求，调查内容、调查方法、标本采集与鉴定、数据处理等技术要求。

本文件适用于野生越橘植物根际细菌、真菌资源调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性应用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T1736?微生物肥料菌种鉴定技术规范

NY/T2066?微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链反应（PCR）法

SC/T7019?水生动物病原微生物实验室保存规范

DB2500草原植物资源调查技术规程

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4工具与器材

GPS定位仪、采集刀（铲）、冰盒、纸袋、塑封袋、记录本、记录笔、标签、数码相机以及个人用品等。

5调查流程

5.1调查对象

选定调查区域内野生越橘根际可培养真菌、细菌。

5.2调查要求

野生越橘根际可培养真菌、细菌的调查一般在植株生长旺盛的季节开展，最好在春季、夏季和秋季各开展调查一次。通过查阅资料，结合访谈（问）法，了解调查地区野生越橘种类及生态系统类型，选定要调查的区域。野生越橘根际可培养真菌、细菌的鉴定需要专业人士根据其形态学特征和分子生物学等特征进行。

5.3调查内容

了解调查地区野生越橘根际细菌、真菌种类、密度、分布及生长环境等特佂。

A)真菌、细菌种类；

B)数量或密度；

C)生境；

D)营养类型；

E)分布特点；

F)利用现状及潜力。

5.4调查方法

采用样方调查法。在调查区域内，根据生境设立面积大小为10m×2m的样方，进行采样、分离，最终记录样地内野生越橘根际可培养真菌、细菌及生境信息。

5.5样品采集及微生物鉴定

调查中记载生态环境（地形、植被、温湿度、海拔等），拍摄生境数码照片。

5.5.1土壤来源

在自然分布区实地采集正常生长的健康越橘植株，带土置于专用冷链箱中，4h内带回实验室直接处理：轻缓取出，抖落根部土壤，未抖落的留存土为根际土。

5.5.2分离与纯化培养基

根际细菌分离与纯化培养采用NA、LB、TSA培养基，根际真菌分离与纯化培养采用PDA、MEA培养基。

5.5.3分离与纯化方法

采用稀释平板涂布法分离、纯化。

A)野生越橘根际可培养细菌的分离：采集紧贴植物根部的根际土壤1g，将土样置于内含玻璃珠和99mL无菌水的锥形瓶中，37℃，180rpm震荡30min，制成土壤悬浊液，在80℃水浴30min，每隔5min震荡混匀。取土壤悬浊液1mL采用连续稀释法配成浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤悬浊液，每一浓度吸取100μL涂布于NA、LB、TSA固体培养基，每一浓度重复涂布3次。37℃恒温培养箱培养24h。将不同形态的菌落在新的平板上反复纯化，直至平板上菌落表面形态特征相同并出现单菌落。参考《BergeysManualofSystematicBacteriology》(9th)定期观察菌落大小、边缘、颜色、光泽、透明度特征。将纯化的菌株进行保存。

B)野生越橘根际可培养真菌的分离：取采集的植物根际土壤1g，移入装有9mL无菌水的试管中进行梯度稀释，稀释度分别为10-1~10-3，各取