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基于高通量测序的病原体筛查通用准则

引言

高通量测序技术具有高通量、低成本和广泛适用等优势，在病原体筛查中革新了传统检测方法。它能高效准确地发现和鉴别各类病原体，加速疾病诊断和治疗。制定此通用准则旨在规范测序技术在病原体筛查中的应用，保证筛查结果的准确性、可靠性及可重复性。

样本采集与处理

样本类型

病原体筛查的样本来源多样，涵盖人体样本（如血液、痰液、咽拭子）、环境样本（如水样、土壤）和动物样本（如组织、排泄物）等。不同样本适用于检测不同类型的病原体，比如血液样本常用于检测血液传播病原体，痰液样本适用于呼吸道病原体检测。

样本采集

1.人体样本

-血液样本：应严格遵循无菌操作，使用合适的采血管（如含有抗凝剂的EDTA管），从肘部静脉采血，一般采集2-5mL。采血后需轻轻颠倒混匀，避免样本凝集。

-痰液样本：要求患者清晨起床后先漱口，然后用力咳出深部痰液，收集于无菌容器中。

-咽拭子：用无菌棉拭子在患者双侧扁桃体及咽后壁擦拭，避免触及口腔其他部位，采集后立即放入保存液中。

2.环境样本

-水样：使用无菌容器在目标水域不同位置多点采集，每个采样点采集约500mL水样，充分混合后取适量用于检测。

-土壤样本：采集表层5-10cm深度的土壤，用无菌铲子或采样器采集，将多点样本混合后取10-20g作为检测样本。

3.动物样本

-组织样本：在动物解剖时，选取目标组织（如肝脏、肺脏等），用无菌器械采集约1-2g组织，放入无菌容器中。

-排泄物样本：使用无菌棉拭子蘸取新鲜排泄物，放入保存液中；或直接采集适量排泄物放入无菌容器。

样本运输与保存

1.样本应在采集后尽快送检，若不能及时送检，需根据样本类型选择合适的保存条件。血液样本可在4℃保存24-48小时，也可-80℃长期保存。

2.痰液、咽拭子等样本在4℃保存不超过48小时，或-20℃短期保存、-80℃长期保存。环境样本如水样在4℃可保存2-3天，土壤样本在-20℃保存。

3.样本运输过程中要保证冷链运输，避免样本受到剧烈震动和高温影响。采用专门的样本运输箱，内置冰袋，保持低温环境。

样本预处理

1.去除杂质：对于血液样本，可通过离心去除血细胞，留取上清液；痰液样本可加入液化剂处理后离心取沉淀。

2.核酸提取：采用合适的核酸提取方法（如磁珠法、柱提法）提取样本中的核酸。对于病毒核酸提取，需注意提取过程中的RNA酶污染问题，可使用RNA酶抑制剂。提取后的核酸应进行质量检测，如通过凝胶电泳检测核酸完整性，用分光光度计测定核酸浓度和纯度。核酸A260/A280比值应在1.8-2.0之间，A260/A230比值应大于2.0。

文库构建

文库类型的选择

1.全基因组文库：适用于未知病原体的全面筛查，可检测到各种类型的病原体基因组，包括病毒、细菌、真菌等。其优点是能提供完整的病原体基因组信息，但测序成本相对较高。

2.转录组文库：用于检测病原体的转录活性，适用于研究病原体在感染过程中的基因表达情况。可分析病原体的致病机制和宿主-病原体相互作用。

3.靶向富集文库：针对已知病原体的特定基因区域进行富集，能提高检测灵敏度和准确性，适用于已知病原体的快速检测和分型。

文库构建流程

1.DNA片段化：通过物理方法（如超声破碎）或酶学方法（如限制性内切酶消化）将提取的核酸片段化为合适大小（一般200-500bp）的片段。超声破碎时需设置合适的超声参数，如功率、时间等，以获得理想的片段长度分布。

2.末端修复和加A尾：使用末端修复酶对片段化的核酸进行末端修复，使其成为平末端；然后在3端加上A碱基，便于后续接头连接。

3.接头连接：将特定的测序接头连接到核酸片段末端，接头序列包含测序引物结合位点和样本标签等信息。连接反应中要注意接头浓度和连接酶的使用量，连接产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，确认连接效果。

4.文库扩增：采用聚合酶链式反应（PCR）对连接好的文库进行扩增，增加文库分子数量。PCR反应条件包括引物浓度、退火温度、循环数等需进行优化，避免非特异性扩增。扩增后的文库应通过Qubit或Agilent2100Bioanalyzer等方法进行定量和质检。

文库质量控制

1.文库浓度：使用Qubit荧光定量法准确测定文库浓度，合适的文库浓度有助于后续测序反应的顺利进行。一般要求文库浓度在1-10nmol/L之间。

2.片段大小分布：通过Agilent2100Bioanalyzer或凝胶电泳分析文库的片段大小分布，文库主峰应在目标片段