奇异变形杆菌PCR检测方法（征求意见稿）.pdf

奇异变形杆菌PCR检测方法（征求意见稿）

1范围

本文件规定了实验动物大小鼠奇异变形杆菌的PCR检测方法。

本文件适用于实验动物大小鼠奇异变形杆菌核酸定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其

中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，

其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14926实验动物微生物检测方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）

体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板DNA先经高温变性成为单链，

在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与

模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚

合酶的作用下以四种dNTP为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火

和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

PCR：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)

EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)

TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液（tris-acetate-EDTA）

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NTC：模板对照（NoTemplateControl）

5原理

用合适的方法提取样本中的DNA，分别针对病原菌16sRNA或其他保守的

基因设计特异的引物，通过PCR对模板进行扩增，根据PCR反应结果分析该样

品中是否含有某种病原菌。

6仪器设备

6.1PCR仪。

6.2电泳仪。

6.3凝胶成像分析系统。

6.4普通离心机。

6.5恒温孵育器。

6.6漩涡振荡仪。

6.7组织匀浆器。

6.8生物安全柜。

6.9超净工作台。

6.10冰箱（-20℃）。

6.11冰箱（-80℃）。

6.12微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，

100μL～1000μL。

6.13采样工具：剪刀、镊和灭菌棉拭子等。

7试剂和材料

7.1引物

上游引物：5′-GGTGATGACCGTAGCAGGTACAAGT-3′

下游引物：5′-TTGCCCCTCACGGTAATGAA-3′

7.2试剂

7.2.1以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，所用的水为双蒸水或去离子

水，应符合GB/T6682所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为

无DNA酶、无RNA酶水。

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7.2.2灭菌离心管（1.5mL、2mL、15mL），灭菌吸头（10μL，200μL，1

mL），灭菌PCR扩增反应管（0.2mL，八连管或96孔板）

7.2.3灭菌PBS，配制方法见附录A。

7.2.4DNA抽提试剂：粪便DNA纯化试剂