系统生物学合成生物学与转录组学.pptVIP

图像扫描Cy5Cy3第26页，共69页，星期日，2025年，2月5日归一化第27页，共69页，星期日，2025年，2月5日LimitofDetection:1in30,000transcripts ~20transcripts/cellRed–increaseofCy5sampletranscriptsGreen–increaseofCy3sampletranscriptsYellow–equalabundance第28页，共69页，星期日，2025年，2月5日差异基因筛选原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法对差异基因进行统计推断。方法：倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5Z值法：Z=(X-μ)/σ作用：发现两个样本间的差异表达基因，便于后续分析。第29页，共69页，星期日，2025年，2月5日MicroarrayandGeneChipApproachesAdvantages:RapidMethodanddataanalysiswelldescribedandsupportedRobustConvenientfordirectedandfocussedstudiesDisadvantages:ClosedsystemapproachDifficulttocorrelatewithabsolutetranscriptnumberSensitivetoalternativesplicingambiguities第30页，共69页，星期日，2025年，2月5日第31页，共69页，星期日，2025年，2月5日高通量测序高通量测序技术（High-throughputsequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。第32页，共69页，星期日，2025年，2月5日第33页，共69页，星期日，2025年，2月5日高通量测序中重要名词解释1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10×。2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。第34页，共69页，星期日，2025年，2月5日3、RPKM（readsperkilobasepermillionreads）是每百万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:其中，totalexonreads指映射到某个基因上的reads数，mappedreads指map到所有基因的总的reads数。RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。第35页，共69页，星期日，2025年，2月5日基于illumina测序的转录组分析：

RNA-seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第36页，共69页，星期日，2025年，2月5日TotalRNA样品检测Agilent2100检测OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7第37页，共69页，星期日，2025年，2月5日第一天消化DNAmRNA的分离mRNA的打断cDNA的合成↓↓第二天末端修复↓↓加接头胶回收3’端加A第三天PCRPCR胶回收↓↓文库制备↓↓第38页，共69页，星期日，2025年，2月5日cDNA:为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDN