（高清版）DB13∕T 2593-2017 禽腺病毒4型PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220

B43

DB13

河北省地方标准

DB13/T2593—2017

禽腺病毒4型PCR检测方法

2017-12-22实施2017-11-22发布

2017-12-22实施

河北省质量技术监督局发布

I

DB13/T2593—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、陈赛娟、李杰峰。

DB13/T2593—2017

禽腺病毒4型PCR检测方法

1范围

本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

DNA

脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

2.2

EB

溴化乙锭(ethidiumbromide)

2.3

PCR

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)

2.4

dNTP

脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)

3试剂或材料

包括各种市售病毒核酸提取试剂盒，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB,10ug/μL)

或核酸染料，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准(100bp),2×TaqMasterMix或商品化的一步法PCR反应试剂。

警示：电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。

3.1病毒核酸提取试剂盒。

3.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。

3.350×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。

3.4溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。

3.5焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。

工

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DB13/T2593—2017

3.6DNA分子量标准(100bp):包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分子量标准。

3.72×TaqMasterMix。

3.8商品化的一步法PCR反应试剂：含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。

3.9引物：上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。

4仪器设备

4.1PCR仪：温度范围4.0℃~99.9℃;样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。

4.2凝胶成像系统：检测灵敏度DNA≥0.1ng;有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。

4.3台式低温高速离心机：最高转速16000r/min;容量1.5mL×12。

4.4电泳仪：电压50V～120V,电流10mA～800mA,定时Omin～999min。

4.5电泳槽：耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。

4.6冰箱：具有冷藏功能。

4.7微量移液器：单道可调；量程包括0.5～10μL、2～20μL、10～100μL、100～1000μL。

4.8水浴锅：温度范围为室温～100℃。

5样品

5.1阴阳性对照

以灭活的禽腺病毒4型鸡胚尿囊液作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。

5.2样品的采集与处理

5.2.1采集工具

下列的采集工具应经121℃±2℃,20min高压灭菌并烘干：

a)棉拭子；

b)剪刀；

c)镊子；

d)1.5mL离心管；

e)研钵。

5.2.2棉拭子采集

将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS(配制方法见附录A中A.5)的1.5mL的离心管，加盖，编号。

5.2.3组织采集

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